RNAm6A修飾問題匯總（第二期）
上期推出了第一期m6A修飾的相關問題匯總，解答了有關m6A修飾的一些入門級問題，本期繼續(xù)推出相關問題匯總，深入探討m6A機制研究的難點與挑戰(zhàn)。m6A的研究故事怎么講？之前的研究思路在自己所關注的疾病過程中是否適用？一直在討論穩(wěn)定性、翻譯效率、降解等關鍵詞，但m6A這些作用是普適性的功能還是具有時空特異性？隨著研究成果的不斷積累和相關討論的不斷深入，是時候系統(tǒng)性的總結歸納現(xiàn)有研究對我們的啟發(fā)與思考了。在第二期問題匯總中，一起來看看有哪些有關機制討論的相關問題被研究者關注，文中相關觀點和文獻支持結合2021年發(fā)表的文獻綜述進行討論，感興趣的老師可以后臺回復“文獻”進行索取。
參考文章封面：
文章原文：m6A RNA methylation: from mechanisms to therapeutic potential
有關m6A修飾的序列偏好性、區(qū)域偏好性、位置選擇、METTL3/METTL14、m6A發(fā)生的內(nèi)外調控系統(tǒng)、時空特異性問題請見上一期文章。本期將重點圍繞Reader蛋白和Eraser蛋白討論研究者經(jīng)常關心的其他問題：
1.Reader蛋白可以識別并結合m6A位點，這種結合有什么特征？對結合的RNA穩(wěn)定性有什么影響？
在綜述文章中，作者描述依賴于m6A降解和翻譯的過程是“context-dependent”，這里的context指的是被m6A修飾mRNA分子具體的相關特征，也就是結合帶來的影響要看修飾位點的位置、區(qū)域、Reader蛋白的類型，以及最重要的被修飾RNA分子的特征。
目前多個相關研究中達成共識的是m6A可以通過YTHDF2分子結合降低mRNA穩(wěn)定性，與之相反的是IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3識別m6A位點增強mRNA穩(wěn)定性（圖1）。RIP-seq可以看到YTHDF2蛋白的結合位點信息與m6A的位點分布近似，但是IGF2BP1-3分子的結合位點的分布則與這兩者不同。不同之處在于IGFBP1-3結合位點沒有富集于終止密碼子，而是均衡分布于3’UTR區(qū)，IGF2BP1-3和YTHDF2的結合位點重合度也比較低。盡管IGF2BP1-3與m6A RNA結合的模式還沒有完全解析，但是可以推測他們是通過KH功能域同m6A RNA結合。因此，被m6A修飾的RNA片段是和IGF2BP1-3結合變得更加穩(wěn)定，還是和YTHDF2結合變得不穩(wěn)定，主要還是看m6A RNA片段的周圍序列特征和相應結合的蛋白活性。
圖1：敲低IGF2BPs降低mRNA穩(wěn)定性
(Recognition of RNA N6-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation)
2.Reader蛋白對結合的RNA翻譯過程有什么影響？
m6A影響mRNA翻譯也是有類似的特征，相關研究顯示在HeLa細胞和子宮內(nèi)膜癌細胞中，YTHDF1選擇性的結合到m6A修飾轉錄本并增強翻譯效率，但是這種YTHDF1對翻譯的上調作用是否明顯主要還是看具體的細胞環(huán)境，在HEK293T細胞系和乳腺癌細胞系中人工構建的m6A報告基因的上調效果就并不明顯。最近圍繞學習和記憶缺陷的小鼠模型的研究中發(fā)現(xiàn)，這種情況下YTHDF1介導的翻譯上調作用有可能由外界的刺激因素而誘導引發(fā)，海馬特異的敲除YTHDF1可以引起小鼠的空間記憶缺陷和情景恐懼記憶（contextual fear memory）。在培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元的穩(wěn)態(tài)環(huán)境中，YTHDF1對翻譯的影響相對溫和，但是在使用氯化鉀去極化處理后，這種影響會變得更加明顯，同時在圍繞背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion）的研究發(fā)現(xiàn)，雖然正常情況下YTHDF1對背根神經(jīng)節(jié)的影響比較微小，但是在損傷誘導軸突再生過程中，YTHDF1促進蛋白合成是必不可少的環(huán)節(jié)。
圖2： YTHDF1增強m6A修飾基因的翻譯對神經(jīng)刺激產(chǎn)生應答
(m6A facilitates hippocampus-dependent learning and memory through YTHDF1)
m6A修飾的具體位置也會改變YTHDF1對于翻譯的影響，5’UTR m6A能夠增強非帽結構依賴的翻譯起始，在CDS區(qū)域的m6A位點可以調控翻譯延伸，終止密碼子附近和3’UTR的m6A位點可以被YTHDF1和YTHDF3識別，增強翻譯起始，總而言之，不同的位置修飾位點，對RNA帶來的影響也會有所區(qū)別。
3.除了mRNA本身以外，m6A對非編碼的影響如何？又是怎樣發(fā)揮功能的？
除了mRNA發(fā)生m6A修飾以外，非編碼RNA同樣廣泛存在m6A修飾是被廣泛認同的事實，只是之前大部分研究聚焦在mRNA m6A。在另外一類非編碼RNA分子中（綜述文章稱為非編碼染色體相關調控RNA，non-coding chromosome-associated regulatory RNA，carRNA）m6A修飾同樣重要，m6A本身可以造成這些carRNA的降解從而影響這些非編碼RNA分子的臨近基因。舉個例子，在自我更新和分化的ESCs中，早期的研究關注的是細胞質m6A閱讀蛋白對整個細胞表型的影響，細胞質中，編碼多能性維持因子蛋白的轉錄本容易發(fā)生m6A修飾進而被YTHDF2結合促進其降解，細胞也在特定時間點從胚胎干細胞開始分化，Mettl3敲除導致早期胚胎致死，Ythdf2敲除鼠可以維持到胚胎發(fā)育晚期，所起作用類似于在核中敲除Ythdc1（核m6A Reader蛋白），說明m6A可能在細胞核中也發(fā)揮重要作用。
圖3：carRNA的m6A位點調控染色質開放狀態(tài)以及轉錄活性
(m6A RNA methylation: from mechanisms to therapeutic potential)
高通量測序的結果表明，METTL3不僅可以催化帶有polyA結果的mRNA和lincRNA發(fā)生m6A修飾，同時，對非polyA結構的線性轉錄本、啟動子相關轉錄本（promoter-associated RNA）、增強子RNA（enhancer RNA）、轉座元件來源RNA（repeats RNA）也發(fā)生m6A修飾，這些非編碼RNA分子被統(tǒng)稱為carRNA，其中15%-30%均含有m6A修飾，METTL3敲除可以廣泛的上調這些RNA豐度。METTL3的敲除可以增強染色質的開放性，廣泛的上調轉錄活性（圖3），由于paRNA和eRNA是部份基因轉錄的上游調控因子，因此這些m6A修飾的paRNA或者eRNA在METTL3敲除后均能上調靶分子，m6A水平下降可以延長carRNAs的半衰期，最終上調下游基因的轉錄，提高局部H3K4me3和H3K27ac的水平，表明m6A修飾carRNA可以間接實現(xiàn)調控轉錄的過程。
4.去甲基化的調控過程是怎樣的？
m6A過程動態(tài)可逆的特點是非常重要的，ALKBH5和FTO是兩個目前認為最重要的去甲基化酶，在癌癥進展、免疫和精子形成過程中都發(fā)揮重要作用。FTO的特點是功能非常強大，強大到在很多病理、生理過程中都能發(fā)揮作用，對于分子來講，從pre-mRNA、可變剪切、多聚APA到翻譯，FTO每時每刻都在發(fā)揮作用；FTO的底物非常廣泛，以至于m6A、m6Am、tRNA m1A都能被FTO調控發(fā)生去甲基化，有關于FTO活性和底物的爭論還有很多。研究表明，對于FTO的底物選擇更多的依賴于FTO的亞細胞定位，對m6A去甲基化作用更多的是在細胞核中被報道，對m6Am的去甲基化作用更多的研究是圍繞細胞質進行。由于FTO的作用十分強大，且底物分布十分廣泛，在AML細胞甚至FTO介導了40% mRNA m6A的去甲基化過程，有關FTO作用主導的調控細節(jié)仍有不少爭論點，下面的例子說明，想要研究清楚FTO到底通過哪條途徑影響表型并不是一件容易的事。
圖4：FTO可以作用m6A，m6Am，m1A三種甲基化修飾類型
(Differential m6A, m6Am, and m1A Demethylation Mediated by FTO in the Cell Nucleus and Cytoplasm)
由于FTO的影響涉及多種底物，因此對特定過程中FTO對其生物功能影響是比較復雜的，例如FTO的敲除大部分情況會引起小鼠模型的胚胎致死，即便是幸存的模型鼠發(fā)育明顯缺陷，體重較對照更輕，那這種表型變化到底是由于FTO使哪種底物的m6A修飾發(fā)生了去甲基化作用而產(chǎn)生？
分別做實驗來看，首先敲除介導mRNA帽子結構和U2 snRNA m6Am修飾的Pcif1或者Mettl4酶，表型不明顯，也不影響小鼠的生存情況，但是敲除Mettl13、Mettl14（催化mRNA m6A）就會明顯引起胚胎致死，需要注意的是，相比于Fto敲除，Mettl14\Mettl3 敲除鼠表現(xiàn)出更嚴重的發(fā)育問題，而Fto敲除鼠的發(fā)育問題相比Pcif1或者Mettl4敲除鼠更嚴重，因此cap mRNA、U2 snRNA m6Am甲基化對于胚胎發(fā)育過程并沒有那么廣泛。這些比較實驗說明，mRNA 和U2 snRNA m6Am修飾的去甲基化并不是造成Fto敲除導致發(fā)育缺陷表型的主要原因。
5.Open Question：當前m6A研究的難點和挑戰(zhàn)在哪里？
m6A對mRNA的功能影響是多變且多面的，舉兩個例子來看：在Hela細胞中，YTHDF蛋白均促進RNA降解，結合位點、蛋白相互結合以及亞細胞定位pattern均呈現(xiàn)相似的結果，研究結果甚至表明YTDHF1在Hela細胞中并不能促進翻譯；第二項研究中，Lasman等人發(fā)現(xiàn)在小鼠的早期發(fā)育過程中，mESCs中三個閱讀蛋白之間存在代償關系，相比于同時敲除三個蛋白，單獨敲除某一個Ythdf蛋白不會造成mESC分化和mRNA的降解。由此看出，針對包括Writer、Reader、Eraser在內(nèi)的各項研究都具有自己的特點和特性，并不能以一蓋全，整個調控過程極其復雜，甲基化去甲基化的動態(tài)過程受多方面調控，因此針對特定的生物學過程的相關表型，結合之前的類似研究，進行綜合性的評價和討論，才能完善m6A的調控機制和作用關系。
圖5：YTHDF蛋白功能網(wǎng)絡
(YTHDF3 facilitates translation and decay of N6-methyladenosine-modified RNA)
第二期的總結當中，討論了一些有關m6A RNA的重要機制問題，整體來看RNA m6A的功能多樣，分布廣泛，在不同的生物學過程中既有共性也有特性，下一期的RNA m6A問題總結中，我們將整理一些有關m6A分析的常用生信工具和技術手段，方便各位研究者查詢有效信息，輔助m6A相關研究，敬請期待！
