ACE2血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（一種血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（二肽羧肽酶家族的ACE樣核酸外切酶）主要在心臟，腎臟和睪丸的血管內(nèi)皮細胞中表達。羧肽酶血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）將八肽血管緊張素（Ang）-II水解為七肽Ang-（1-7），對血糖具有重要的保護作用。 ACE2基因敲除小鼠對葡萄糖的反應(yīng)是耐量降低和胰島素分泌受損。相反，為胰腺提供ACE2基因治療可以改善db / db小鼠血糖和原代細胞功能，這是肥胖癥誘發(fā)的糖尿病常見的遺傳模型。

TALEN的RNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生了遠距離的Ace2基因敲除小鼠，表明結(jié)腸炎讓人聯(lián)想到病理生理學(xué)和炎癥

血管緊張素I轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）是維持腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素。體內(nèi)穩(wěn)態(tài)障礙會導(dǎo)致結(jié)腸發(fā)炎（結(jié)腸炎），從而導(dǎo)致危及生命的虛弱甚至癌癥。動物模型是解讀此類人類疾病背后的病理學(xué)和篩選假設(shè)的治療靶點或范例的有價值的替代方法。但是，疾病模型的開發(fā)可能很耗時并且需要技術(shù)，這可能會影響其應(yīng)用價值。在這項研究中，我們直接將體外轉(zhuǎn)錄的編碼轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)子核酸酶（TALENs）的mRNA注入遠交昆明小鼠受精卵的細胞質(zhì)中，從而遺傳破壞了小鼠Ace2基因。因此，誘導(dǎo)體細胞突變的效率為57％，其中39％為移碼突變。而且，所有修飾在種系傳遞過程中均穩(wěn)定轉(zhuǎn)移。在Ace2基因敲除技術(shù)，系雄性小鼠（Ace2- / y）中，研究人員觀察到嚴重的化學(xué)誘導(dǎo)性結(jié)腸炎，其特征在于體重減輕，腹瀉和結(jié)腸長度縮短。從組織學(xué)上講，Ace2突變會引起白細胞浸潤并嚴重破壞腸粘膜屏障。此外，研究人員發(fā)現(xiàn)，Ace2- / y小鼠結(jié)腸組織中炎性細胞因子的表達增加?？傮w而言，數(shù)據(jù)顯示通過合體注射TALEN mRNA，可以在雜種小鼠模型中實現(xiàn)高靶向效率和遺傳性。另外，所得的Ace2-// y小鼠表現(xiàn)出讓人聯(lián)想到結(jié)腸炎的表型特征，并且研究人員期望這種小鼠在腸道微生物組或糞便移植的研究中可能具有價值。

ACE2/血管緊張素（1-7）/ Ma軸在骨肉瘤細胞U-2 OS和MNNG-HOS中的表達和功能

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）通過其經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）/血管緊張素II /1型受體（AT1R）軸轉(zhuǎn)移與各種實體瘤的增殖作用。在骨肉瘤的小鼠模型中，AT1R阻滯劑可以減少腫瘤體積，并減少肝和肺轉(zhuǎn)移。替代性ACE2 / Ang（1-7）/ Ma軸在骨肉瘤中的表達和功能仍有待研究。在這項研究中，分析了替換RAS軸的基本成分和白介素（IL）-1β刺激的表達，并研究了Mas對U-2 OS和MNNG-HOS骨肉瘤細胞增殖和/或遷移的影響。研究聚合酶鏈反應(yīng)顯示這兩個細胞系均表達Ang（1-7）肽酶ACE2，中性內(nèi)肽酶24.11，脯氨酰-內(nèi)肽酶和Ang（1-7）。身體Mas。 IL-1β誘導(dǎo)Mas ?mRNA和蛋白的表達，這與增殖和遷移的減少有關(guān)。相反，小的干擾RNA介導(dǎo)的Mas表達的敲低導(dǎo)致細胞增殖增加。總之，骨肉瘤細胞表達ACE2 / Ang（1-7）/ Mas軸的功能活性替代。通過減少生長并預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移，該軸的誘導(dǎo)和增強可能對骨肉瘤的治療有益。這些作用可以通過直接施用Mas激動劑來實現(xiàn)，也可以通過ACE抑制劑或AT1R拮抗劑阻斷經(jīng)典的AngII RAS軸來間接實現(xiàn)。

血管緊張素II通過p38絲裂原激活的蛋白激酶和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)神經(jīng)元中的ACE和ACE2

腦ANG II在調(diào)節(jié)交感功能和體內(nèi)平衡中起重要作用。 ANG II的產(chǎn)生和降解在很大程度上分別通過血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）和ACE2進行。在疾病狀態(tài)，例如高血壓和慢性心力衰竭中，ACE的中央表達上調(diào)，而ACE2在中央交感神經(jīng)元中減少。在這項研究中，研究人員確定了神經(jīng)元細胞培養(yǎng)物中ACE和ACE2對ANG II的反應(yīng)及其后續(xù)信號傳導(dǎo)機制的表達。小鼠兒茶酚胺能神經(jīng)元細胞系（CATH.a）用ANG II（30、100和300 nM）處理24小時，并通過蛋白質(zhì)印跡分析確定蛋白表達。 ANG II誘導(dǎo)了CATH.a神經(jīng)元中ACE的劑量依賴性顯著增加以及ACE2 mRNA和蛋白表達的降低。在給予ANG II或ERK1 / 2抑制劑U-0126（10μM）之前30分鐘，用p38 MAPK抑制劑SB-203580（10μM）對細胞進行預(yù)處理，從而消除了這種作用。這些數(shù)據(jù)表明，ANG II通過ANG II 1型受體，p38 MAPK和ERK1 / 2信號通路增加ACE并減弱神經(jīng)元中ACE2的表達。

由Ubigene開發(fā)的CRISPR-U?（基于CRISPR / Cas9技術(shù)）在雙鏈斷裂方面比普通CRISPR / Cas9更有效，而CRISPR-U?可以大大提高同源重組的效率，輕松實現(xiàn)敲除（KO），體外和體內(nèi)的點突變（PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U，Ubigene已成功編輯了100多個細胞系上的基因。

Reference

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基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產(chǎn)生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細胞敲除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產(chǎn)生了EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達的機制。

根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計。

方案1：小片段基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子2兩端的內(nèi)含子中，敲除外顯子編碼堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可造成移碼。

方案2：移碼基因敲除方案，gRNA設(shè)在外顯子上，缺失的堿基數(shù)為非3倍數(shù)，敲除后可發(fā)生移碼突變。

方案3：大片段基因敲除方案，將整個基因的編碼序列敲除，達到大片段敲除的效果。

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