? ? ? ?大家好，今天和大家分享一篇近期剛被?Angewandte Chemie International Edition?接收的工作： “?Ultra-fast cycling for multiplexed cellular fluorescence imaging”。這篇文章的通訊作者是哈佛醫(yī)學(xué)院和麻省總醫(yī)院的?Ralph Weissleder?教授。Weissleder?教授課題組長(zhǎng)期從事細(xì)胞生物學(xué)研究及影像學(xué)診斷，近年來(lái)的研究聚焦于細(xì)胞體內(nèi)顯微成像，生物正交小分子體內(nèi)顯像劑， 納米級(jí)核磁共振實(shí)時(shí)傳感。 近年來(lái)， 他們基于四嗪（?tetrazine，?Tz）和反式環(huán)辛烯（?trans-cyclooctene，?TCO）這一生物正交反應(yīng)對(duì)開(kāi)展了一系列工作。Tz?類(lèi)生物正交化學(xué)于?2008?年報(bào)道后，其異常高效的動(dòng)力學(xué)和高度可功能化等特性吸引了許多生物醫(yī)學(xué)研究者的興趣。這這篇工作中，?Weissleder?教授課題組基于?TCO?和?Tz?分別構(gòu)建了熒光標(biāo)簽和猝滅劑，用于單細(xì)胞熒光成像及熒光信號(hào)的快速猝滅。
? ? ? 細(xì)針針吸細(xì)胞學(xué)（?fine needle aspiration，?FNA）是一種微創(chuàng)的臨床檢查方法，最常用于癌癥檢查中。FNA?通過(guò)對(duì)體表或深部臟器的腫物抽取細(xì)胞（每次抽取?1000?個(gè)細(xì)胞以?xún)?nèi)）進(jìn)行診斷，并通過(guò)染色和成像對(duì)被抽取細(xì)胞進(jìn)行分析。對(duì)于熒光方法來(lái)說(shuō)，由于單次檢測(cè)的熒光標(biāo)記數(shù)局限于?4-6?種，不足以進(jìn)行癌細(xì)胞的深度鑒定，因此，通常會(huì)利用單細(xì)胞循環(huán)標(biāo)記技術(shù)實(shí)現(xiàn)同一細(xì)胞樣本中更多標(biāo)志物的分析。大部分熒光循環(huán)標(biāo)記技術(shù)通過(guò)去標(biāo)記或光漂白去除標(biāo)記物或標(biāo)記信號(hào)，通常需要較為極端的反應(yīng)條件，如強(qiáng)堿性的條件（?pH > 12）用于光漂白，并不適用于少量細(xì)胞樣本的分析。同時(shí)，這些基于化學(xué)鍵斷裂或光漂白的循環(huán)標(biāo)記過(guò)程十分復(fù)雜且耗時(shí)。與化學(xué)鍵斷裂或光漂白的思路不同，本文中作者以基于?Click?反應(yīng)的熒光猝滅為循環(huán)標(biāo)記基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了能夠快速、高效、溫和地實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞循環(huán)標(biāo)記的方法。借助高效的?TCO?和?Tz?生物正交反應(yīng)，該技術(shù)?1 s?以?xún)?nèi)，即能夠?qū)崿F(xiàn)超快速的熒光猝滅；1 h?內(nèi)，能夠通過(guò)多輪標(biāo)記實(shí)現(xiàn)理論上實(shí)現(xiàn)?20-30?種標(biāo)志物的成像分析。
? ? ? 作者首先合成了一系列結(jié)構(gòu)如圖?1A?所示的具有?TCO?結(jié)構(gòu)及熒光發(fā)色團(tuán)的熒光標(biāo)
簽（?FAST probes）。該結(jié)構(gòu)中賴(lài)氨酸作為連接臂：賴(lài)氨酸的羧基與?TCO?的?3’相連，用于保持反式烯烴的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性；一端氨基與熒光發(fā)色團(tuán)相連；另一端氨基通過(guò)(PEG)4?連接?N-羥基琥珀酰亞胺用于與抗體連接。同時(shí)，合成了如圖?1B?所示的具有?Tz?結(jié)構(gòu)以及BHQ3?猝滅基團(tuán)的猝滅劑（?BHQ3-Tz）。該結(jié)構(gòu)中通過(guò)設(shè)計(jì)(PEG)5?連接臂用于增加?Tz?的水溶性，且不影響猝滅效果。BHQ3-Tz?對(duì)于常用熒光標(biāo)簽，如?AF488，?AF594，?AF647，OG488，?AF532，?IR750?等均具有較好的猝滅能力（猝滅效率均大于?90%）。為實(shí)現(xiàn)熒光猝滅信號(hào)定量，作者進(jìn)一步證實(shí)各種?FAST probes?均能對(duì)抗體高效標(biāo)記，標(biāo)記后的抗體均能被?BHQ3-Tz?猝滅。FAST647-labeled anti-EGFR?在加入?BHQ3-Tz?后猝滅了超過(guò)?99%熒光信號(hào)。猝滅后的熒光信號(hào)在生理?xiàng)l件下（PBS，?pH = 7.4），即使?4?小時(shí)后熒光信號(hào)也沒(méi)有明顯反彈（<5%）。證明了熒光猝滅的高重現(xiàn)性、高效性和高穩(wěn)定性。

? ? ? 作者還發(fā)現(xiàn)這種基于?Click?反應(yīng)的猝滅反應(yīng)速度非?？臁８鶕?jù)單純的?Tz-TCO Click

反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)速率常數(shù)?k = 7200 M-1s-1，理論上猝滅反應(yīng)的時(shí)間應(yīng)為?5 min。而實(shí)際上，猝滅反應(yīng)在?10 s?內(nèi)即能完成（圖?2A），猝滅反應(yīng)半衰期?t1/2小于?0.5 s（圖?2B），這種猝滅反應(yīng)的速度比單純的?Click?反應(yīng)還要快速。因此，作者進(jìn)一步對(duì)基于?Tz-TCO Click?反應(yīng)的猝滅動(dòng)力學(xué)性能進(jìn)行探究。作者研究了?FAST probes?標(biāo)記抗體與?BHQ3-Tz?的反應(yīng)速率曲線(xiàn)，其反應(yīng)速率呈現(xiàn)明顯的二級(jí)反應(yīng)特點(diǎn)。經(jīng)計(jì)算，?AF488?體系猝滅反應(yīng)的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)為?7.4x106?M-1s-1，比?Click?反應(yīng)的速率常數(shù)加速了約?1000?倍；AF488?體系猝滅反應(yīng)的二級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)為?2.7x107?M-1s-1，比?Click?反應(yīng)的速率常數(shù)加速了超過(guò)3300?倍。這種反應(yīng)加速即使在高濃度?BSA?蛋白體系及細(xì)胞培養(yǎng)基體系中仍十分明顯，且?guī)缀醪皇荏w系中高蛋白濃度的影響。作者猜測(cè)， 這種相比于?Click?反應(yīng)的進(jìn)一步加速，與熒光團(tuán)-BHQ3?之間原本存在的親和力有關(guān)，但單獨(dú)的熒光團(tuán)-BHQ3?結(jié)合是一個(gè)快速轉(zhuǎn)換的可逆過(guò)程，因此在缺少?Click?反應(yīng)條件下，兩者無(wú)法觀察到明顯的熒光猝滅。TzTCO click?反應(yīng)與熒光團(tuán)-BHQ3?親和關(guān)系協(xié)同加速了猝滅反應(yīng)。

? ? ? 作者將?FAST-probe?標(biāo)記抗體與?BHQ3-Tz?猝滅劑用于小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞的循環(huán)標(biāo)記成像研究中，關(guān)注了細(xì)胞中?12?種免疫標(biāo)志物（CD45，?CD8，?CD3，?CD4，?PD-1，?CD11b，F(xiàn)4/80，?MHCII，?CD163，?CD206，?Ly6G，?CD11c）。細(xì)胞分析流程如下：相關(guān)細(xì)胞均由FNA?技術(shù)取樣獲得，取樣后的細(xì)胞清洗后制成細(xì)胞涂片；染色前先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定和通透，并用?1% BSA-PBS?封閉；小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞分析中，每批次標(biāo)記?3?種無(wú)干擾性標(biāo)記抗體，并加入?DAPI?染色用于細(xì)胞定位，抗體等標(biāo)簽與細(xì)胞孵育?15-30 min?后用于成像分析；成像后加入?BHQ3-Tz?猝滅劑清洗細(xì)胞（10 s?內(nèi)完成）；循環(huán)標(biāo)記-成像-猝滅過(guò)程，12?種免疫標(biāo)志物通過(guò)?4?輪標(biāo)記-成像完成（圖?3A）。CD45?作為免疫細(xì)胞的主要標(biāo)志物在第一輪標(biāo)記中用于篩選出?CD45+DAPI+免疫細(xì)胞。借助?Cell Profiler?細(xì)胞成像分析軟件，作者在?11?個(gè)成像區(qū)域篩選出?1846?個(gè)?CD45+免疫細(xì)胞用于進(jìn)一步分析。在這些細(xì)胞中，進(jìn)一步鑒定區(qū)分出?CD8+?T?細(xì)胞，?CD4+?T?細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹(shù)突狀細(xì)胞，中性粒細(xì)胞等多種細(xì)胞類(lèi)型（圖?3B）。

? ? ? 綜上，作者發(fā)展了一種超快速、高效率的循環(huán)標(biāo)記方法用于單細(xì)胞熒光成像分析?；谒泥?Tz?和反式環(huán)辛烯?TCO?的?Click?反應(yīng)設(shè)計(jì)并合成了能夠?qū)崿F(xiàn)快速猝滅的抗體熒光標(biāo)簽及猝滅劑，其猝滅反應(yīng)的半衰期小于?0.5 s，比理論估算值快?3?個(gè)數(shù)量級(jí)。作者將它應(yīng)用于?FNA?技術(shù)抽取的少量細(xì)胞樣品體系，通過(guò)?4?輪標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了?12?種標(biāo)志物的成像分析，且整個(gè)循環(huán)標(biāo)記和成像過(guò)程均能在?1h?左右完成。這種快速高效的分析方法對(duì)于癌癥診斷治療及腫瘤微環(huán)境研究具有重要意義。

原文獻(xiàn)連接：https://doi.org/10.1002/anie.201915153