分子生物學(xué)

1．?DNA的一級結(jié)構(gòu)：指DNA分子中核苷酸的排列順序。

2．?DNA的二級結(jié)構(gòu)：指兩條DNA單鏈形成的雙螺旋結(jié)構(gòu)、三股螺旋結(jié)構(gòu)以及四股螺旋結(jié)構(gòu)。

3．?DNA的三級結(jié)構(gòu)：雙鏈DNA進一步扭曲盤旋形成的超螺旋結(jié)構(gòu)。

4．?DNA的甲基化：DNA的一級結(jié)構(gòu)中，有一些堿基可以通過加上一個甲基而被修飾，稱為DNA的甲基化。甲基化修飾在原核生物DNA中多為對一些酶切位點的修飾，其作用是對自身DNA產(chǎn)生保護作用。真核生物中的DNA甲基化則在基因表達調(diào)控中有重要作用。真核生物DNA中，幾乎所有的甲基化都發(fā)生于二核苷酸序列5’-CG-3’的C上，即5’-mCG-3’.

5．?CG島：基因組DNA中大部分CG二核苷酸是高度甲基化的,但有些成簇的、穩(wěn)定的非甲基化的CG小片段,稱為CG島,存在于整個基因組中?！癈G”島特點是G+C含量高以及大部分CG二核苷酸缺乏甲基化。

6．?DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點：

（1）?DNA是反向平行的互補雙鏈結(jié)構(gòu)。

（2）?DNA雙鏈是右手螺旋結(jié)構(gòu)。螺旋每旋轉(zhuǎn)一周包含了10對堿基，螺距為3.4nm. DNA雙鏈說形成的螺旋直徑為2 nm。每個堿基旋轉(zhuǎn)角度為36度。DNA雙螺旋分子表面存在一個大溝和一個小溝，目前認為這些溝狀結(jié)構(gòu)與蛋白質(zhì)和DNA間的識別有關(guān)。

（3）?疏水力和氫鍵維系DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定橫向依靠兩條鏈互補堿基間的氫鍵維系，縱向則靠堿基平面間的疏水性堆積力維持。

7．?核小體的組成：

染色質(zhì)的基本組成單位被稱為核小體，由DNA和5種組蛋白H1,H2A,H2B,H3和H4共同構(gòu)成。各兩分子的H2A,H2B,H3和H4共同構(gòu)成八聚體的核心組蛋白，DNA雙螺旋纏繞在這一核心上形成核小體的核心顆粒。核小體的核心顆粒之間再由DNA和組蛋白H1構(gòu)成的連接區(qū)連接起來形成串珠樣結(jié)構(gòu)。

8．?順反子（Cistron）：由結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄生成的RNA序列亦稱為順反子。

9．?單順反子（monocistron）：真核生物的一個結(jié)構(gòu)基因與相應(yīng)的調(diào)控區(qū)組成一個完整的基因，即一個表達單位，轉(zhuǎn)錄物為一個單順反子。從一條mRNA只能翻譯出一條多肽鏈。

10．多順反子(polycistron): 原核生物具有操縱子結(jié)構(gòu)，幾個結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄在一條mRNA鏈上，因而轉(zhuǎn)錄物為多順反子。每個順反子分別翻譯出各自的蛋白質(zhì)。

11．原核生物mRNA結(jié)構(gòu)的特點:

(1) 原核生物mRNA往往是多順反子的，即每分子mRNA帶有幾種蛋白質(zhì)的遺傳信息。

（2）mRNA 5‘端無帽子結(jié)構(gòu)，3‘端無多聚A尾。

（3）mRNA一般沒有修飾堿基。

12．真核生物mRNA結(jié)構(gòu)的特點：

???（1）5‘端有帽子結(jié)構(gòu)。即7－甲基鳥嘌呤－三磷酸鳥苷m7GpppN。

???（2）3‘端大多數(shù)帶有多聚腺苷酸尾巴。

???（3）分子中可能有修飾堿基，主要有甲基化。

???（4）分子中有編碼區(qū)和非編碼區(qū)。

14．tRNA的結(jié)構(gòu)特點

（1）tRNA是單鏈小分子。

（2）tRNA含有很多稀有堿基。

（3）tRNA的5‘端總是磷酸化，5’末端核苷酸往往是pG.

（4）tRNA的3‘端是CCA－OH序列。是氨基酸的結(jié)合部位。

（5）tRNA的二級結(jié)構(gòu)形狀類似于三葉草，含二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)）、T環(huán)和反密碼子環(huán)。

（6）tRNA的三級結(jié)構(gòu)是倒L型。D環(huán)和T環(huán)在L的拐角上。

15．rRNA

（1）rRNA是細胞內(nèi)含量最豐富的RNA，它們與核糖體蛋白共同構(gòu)成核糖體，后者是蛋白質(zhì)合成的場所。

（2） 核糖體和rRNA一般都用沉降系數(shù)S表示大小。原核生物核糖體的沉降系數(shù)為70S，由50S和30S兩個大小亞基組成，30S小亞基含有16SrRNA和21種蛋白質(zhì)。50S大亞基含有23S和5SrRNA以及34種蛋白質(zhì)。真核生物沉降系數(shù)為80S，由大小亞基組成。40S小亞基含有18SrRNA和30多種蛋白質(zhì)。60SrRNA含有5S、5.8S和28SrRNA 以及大約45種蛋白質(zhì)。

16．核酶（ribozyme）：某些RNA分子能催化自身或其他RNA分子進行化學(xué)反應(yīng)，即具有酶樣的催化活性，這類具有催化活力的RNA稱為核酶。核酶分為3類：(1) 異體催化的剪切型。（2）自體催化的剪切型 （3）內(nèi)含子的自我剪切型。

17．核內(nèi)不均一RNA（hnRNA）：真核生物轉(zhuǎn)錄生成的mRNA前體即為hnRNA。這類mRNA前體必須經(jīng)過一系列的加工處理才能變成成熟的mRNA。加工過程的主要環(huán)節(jié)包括：（1）5‘端加帽 （2）3’端加尾 （3）內(nèi)含子的切除和外顯子的連接 （4）分子內(nèi)部的甲基化修飾 （5）核苷酸序列的編輯作用。

18．miRNA:是一種單鏈小分子RNA，廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA，其特點就是高度的保守性、時序性和組織特異性。研究表明miRNA可能決定組織和細胞的功能特異性，也可能參與了復(fù)雜的基因調(diào)控，對組織的發(fā)育起重要作用。

19．siRNA：小干擾RNA。是人工合成的短的雙鏈RNA，它可抑制細胞內(nèi)特定基因的表達，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因失活。siRNA是RNAi的重要工具。

20．反義RNA：堿基序列正好和有意義mRNA互補的RNA稱為反義RNA。這類RNA也是單鏈RNA，可與mRNA配對形成雙鏈，最終抑制mRNA作為模板進行翻譯，這是反義RNA主要的調(diào)控功能。

21．順式作用元件（cis-acting element）：真核生物基因中的調(diào)控序列被稱為順式作用元件,包括：啟動子和上游啟動子元件，增強子，反應(yīng)元件，Poly(A)加尾信號。

22．增強子（enhancer）：是一段短的DNA序列，其中含有多個作用元件，可以特異性與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，增強基因的轉(zhuǎn)錄活性。增強子可以位于基因的任何位置，增強子的功能與其位置和方向無關(guān)。

23．基因：是核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，是指貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息及表達這些信息所必需的全部核苷酸序列。一個基因不僅僅包括編碼蛋白質(zhì)肽鏈或RNA的核酸序列，還包括保證轉(zhuǎn)錄所必需的調(diào)控序列及位于編碼區(qū)5‘端上游的非編碼序列，內(nèi)含子和位于編碼區(qū)3’端下游的非編碼序列。

24．基因組：泛指一個細胞或病毒的全部遺傳信息。在真核生物體中，基因組是指一套完整單倍體DNA和線粒體DNA的全部序列，既包括編碼序列，也包括非編碼序列。

25．病毒基因組包括：單鏈正股RNA，單鏈負股RNA，雙鏈RNA，雙鏈DNA和單鏈正股DNA。

26．SARS冠狀病毒屬于：單鏈正股RNA病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒屬于：單鏈正股RNA病毒。

27．逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組包括三個結(jié)構(gòu)基因：gag、pol和env。分別編碼：核心蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶和膜蛋白。

28．操縱子（operon）:是指數(shù)個功能上相關(guān)聯(lián)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起，構(gòu)成信息區(qū)，連同其上游的調(diào)控區(qū)（包括啟動子和操縱序列）和下游的轉(zhuǎn)錄終止信號所構(gòu)成的基因表達單位，所轉(zhuǎn)錄的RNA為多順反子。

29．質(zhì)粒：是存在于細菌染色體之外的、具有自主復(fù)制能力的環(huán)狀雙鏈DNA分子。

30．質(zhì)粒的不相容性：具有相同復(fù)制起始位點和分配區(qū)的兩種質(zhì)粒不能共存于一個宿主菌，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性。

31．轉(zhuǎn)座因子：既可移動的基因成分，是指能在一個DNA分子內(nèi)部或兩個DNA分子之間移動的DNA片段。原核生物的轉(zhuǎn)座因子包括：插入序列、轉(zhuǎn)座子和Mu噬菌體。

32．插入序列: 是一類較小的沒有表型效應(yīng)的轉(zhuǎn)座因子，由一個轉(zhuǎn)位酶基因及兩側(cè)的反向重復(fù)序列組成。

33．轉(zhuǎn)座子：是一類較大的可移動成分，除有關(guān)轉(zhuǎn)座的基因外，至少帶有一個與轉(zhuǎn)座作用無關(guān)的并決定宿主菌遺傳性狀的基因 。

34．?dāng)嗔鸦颍赫婧松锏慕Y(jié)構(gòu)基因，由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)互相間隔而又連續(xù)鑲嵌而成，去除編碼區(qū)再連接后，可翻譯出由連續(xù)氨基酸組成的完整蛋白質(zhì)這些基因稱為斷裂基因。

35．snRNA:核內(nèi)小RNA，分子中尿嘧啶含量最豐富。snRNA和核內(nèi)蛋白質(zhì)組成小分子核糖核蛋白體，作為RNA剪接的場所。

36．啟動子：能夠被RNA聚合酶識別并結(jié)合并起始轉(zhuǎn)錄的核苷酸序列。典型的啟動子包括TATA盒，CAAT盒和GC盒。

37．反應(yīng)元件：一些信息分子的受體被細胞外信息分子激活后，能與特異的 DNA序列結(jié)合，調(diào)控基因的表達。這些特異的DNA序列實際上也是順式元件，由于能介導(dǎo)基因?qū)毎獾哪撤N信號產(chǎn)生反應(yīng)，被稱為反應(yīng)元件。

38．基因家族：指核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。

39．端粒DNA重復(fù)序列：TTAGGG。微衛(wèi)星DNA常見重復(fù)單位(AC)和（TG）。

40．衛(wèi)星DNA：是出現(xiàn)在非編碼區(qū)的串聯(lián)重復(fù)序列。其特點是具有固定的重復(fù)序列，該重復(fù)單位首尾相連形成重復(fù)序列片段，通常存在于間隔DNA和內(nèi)含子中。衛(wèi)星DNA可分為大衛(wèi)星DNA、小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA。

41．端粒：以線性染色體形式存在的真核基因組DNA的末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)，端粒。該結(jié)構(gòu)是一段DNA序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體，僅在真核細胞染色體末端存在。端粒的功能主要有：保護線性DNA的完整復(fù)制，保護染色體末端及決定細胞的壽命等。

42．Alu家族：序列中有限制性內(nèi)切酶Alu的酶切位點。重復(fù)單位是300bp.屬短散在核元件，為靈長類基因組所特有。

43．假基因：是指與某些有功能的基因結(jié)構(gòu)相似，但不能表達基因產(chǎn)物的基因。

44．人類基因組的四張圖譜：遺傳圖、物理圖、序列圖和轉(zhuǎn)錄圖。遺傳圖指基因或DNA標(biāo)記在染色體上以遺傳距離表示的相對位置。物理圖指基因或DNA標(biāo)記間的實際距離。序列圖指人類基因組的全部核苷酸序列，也是最詳盡的物理圖。轉(zhuǎn)錄圖指基因圖譜。

45．端粒酶：由三部分組成，端粒RNA，端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶，端粒酶協(xié)同蛋白。端粒酶兼有提供RNA模版和催化逆轉(zhuǎn)錄酶的功能。端粒酶通過一種爬行模型的機制維持染色體的完整。

46. 半保留復(fù)制：子代細胞的DNA，一股單鏈從親代完整的接受過來，另一股單鏈則完全重新合成，兩個子細胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致，這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。

47. 半不連續(xù)復(fù)制：順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進行的，這股鏈稱為領(lǐng)頭鏈。另一股鏈因為復(fù)制方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，必須等模板鏈解開至足夠長度，然后從5’-3’生成引物并復(fù)制子鏈。延長過程中，又要等待下一段有足夠長度的模板再次生成引物而延長。這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為隨從鏈。領(lǐng)頭鏈連續(xù)復(fù)制而隨從鏈不連續(xù)復(fù)制，這就是復(fù)制的半不連續(xù)復(fù)制。

48. 岡崎片段：隨從鏈的復(fù)制由于與解鏈方向相反，必須待母鏈解開足夠長度后才開始生成引物接著延長。復(fù)制中形成的不連續(xù)復(fù)制片斷就是岡崎片段。

49. 滾環(huán)復(fù)制：是某些低等生物或染色體外的DNA的復(fù)制形式。環(huán)狀DNA外環(huán)打開，伸出環(huán)外作母鏈復(fù)制，內(nèi)環(huán)不打開一邊滾動一邊復(fù)制。最后，一個雙鏈環(huán)就滾動復(fù)制成兩個雙鏈環(huán)。

50.?TT二聚體：在紫外線照射下，相鄰的兩個DNA分子上的嘧啶堿基之間共價結(jié)合而成的。

51. 著色性干皮?。菏怯捎贒NA損傷修復(fù)有缺陷而造成的一種遺傳性疾病，患者有較高的皮膚癌發(fā)病傾向。對該病的研究，發(fā)現(xiàn)了一些與切除損傷部位有關(guān)的蛋白質(zhì)，稱為XP蛋白。

52. 切除修復(fù)：DNA損傷修復(fù)的一種方式。通過切除損傷部位，剩下的空隙由DNA-pol I催化dNTP聚合而填補，最后由DNA連接酶結(jié)合裂隙。切除損傷在原核生物需Uvr蛋白類，真核生物需XP蛋白類。

53.?光修復(fù)：生物體內(nèi)有一種光修復(fù)酶，被光激活后能利用光所提供的能量使紫外線照射引起的嘧啶二聚體分開，恢復(fù)原來的非聚合狀態(tài)，稱為光修復(fù)。

54.?DNA損傷的修復(fù)類型：光修復(fù)、切除修復(fù)、重組修復(fù)和SOS修復(fù)。

55.?重組修復(fù)時，recA蛋白被激活，使得LexA蛋白被水解。

56.?突變的分子改變類型：

（1）錯配:DNA分子上的堿基配對又稱點突變。

(2) ?缺失，插入和框移：缺失和插入都可以導(dǎo)致框移突變。框移突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變，其后果是翻譯出的蛋白質(zhì)可能完全不同。

（3）重排：DNA分子中較大片斷的交換，稱為重組或重排。

57. 點突變分為：轉(zhuǎn)換和顛換。轉(zhuǎn)換是指由一種嘧啶變成另一種嘧啶，或一種嘌呤變成另一種嘌呤。顛換是指由嘧啶變成嘌呤，或由嘌呤換為嘧啶。

58. 突變的意義：

????(1)突變是進化、分化的分子基礎(chǔ)。

????(2)只有基因型改變的突變。

????(3)致死性的突變。

????(4)突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。

59. D－環(huán)復(fù)制：是線粒體DNA的復(fù)制形式。復(fù)制時需合成引物。MtDNA為雙鏈，第一個引物以內(nèi)環(huán)為模板延伸。至第二個復(fù)制起始點時，又合成另一個反向引物，以外環(huán)為模板進行反向的延伸，最后完成兩個雙鏈環(huán)狀DNA的復(fù)制。

60. 逆轉(zhuǎn)錄酶有三種活性：

(1)RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性。

(2)DNA指導(dǎo)的DNA聚合酶活性。

(3)RNA酶H（RNaseH）活性。

61. RNA復(fù)制：是指某些病毒在宿主細胞中以自身RNA為模板，以宿主細胞中的4種dNTP為原料，按5’-3’方向催化合成互補的RNA鏈，此過程稱為RNA復(fù)制。

62. 逆轉(zhuǎn)錄：是指以RNA為模板，利用宿主細胞中4種dNTP為原料，按5’-3’方向催化合成與RNA互補的DNA鏈的過程。

63. 逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制過程：

???（1）逆轉(zhuǎn)錄酶以RNA為模板，催化dNTP聚合生成DNA互補鏈，產(chǎn)物是RNA/DNA雜化雙鏈。

??（2）雜化雙鏈中的RNA被逆轉(zhuǎn)錄酶中有RNA酶活性的組分如RNaseH水解.

???(3) ?利用單鏈DNA為模板，由逆轉(zhuǎn)錄病毒催化合成第2條DNA互補鏈。

64. Klenow片斷具有：DNA聚合酶活性和3’-5’核酸外切酶活性。

65. DNA－pol I的功能：對復(fù)制中的錯誤進行較讀，對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進行填補。

66. DNA復(fù)制的保真性依賴的機制：

??（1）遵守嚴格的堿基配對規(guī)律。

??（2）聚合酶在復(fù)制延長中對堿基的選擇功能。

??（3）復(fù)制出錯時有即時的較讀功能。

67. 引發(fā)體：解螺旋酶，DnaC蛋白，引物酶和DNA起始復(fù)制區(qū)域組成。

68. 拓撲異構(gòu)酶作用：

???（1）拓撲酶I 切斷DNA雙鏈中的一股，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)中不致打結(jié)，適當(dāng)時候又把切口封閉，使DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。

???（2）拓撲酶II 在無ATP時，切斷處于正超螺旋的DNA分子雙鏈某一部位，斷端通過切口使超螺旋松弛；在利用ATP功能的情況下，松弛狀態(tài)的DNA又進入負超螺旋狀態(tài)，斷端在同一酶催化下連接恢復(fù)。

69．復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的異同：

相似之處：

（1）都是酶促的核苷酸聚合反應(yīng)。

（2）都以DNA為模板。

（3）都需依賴DNA的聚合酶。

（4）聚合過程中都是核苷酸之間形成磷酸二酯鍵。

（5）都從5‘-3’方向延伸聚核苷酸鏈。

（6）都遵從堿基配對規(guī)律。

區(qū)別：

（1）模板。復(fù)制：兩股鏈均復(fù)制。轉(zhuǎn)錄：不對稱轉(zhuǎn)錄。

（2）原料。復(fù)制：dNTP。轉(zhuǎn)錄：NTP。

（3）酶。 ?復(fù)制：DNA聚合酶。轉(zhuǎn)錄：RNA聚合酶。

（4）產(chǎn)物。復(fù)制：子代雙鏈DNA（半保留復(fù)制）。轉(zhuǎn)錄：mRNA, rRNA, tRNA.

（5）堿基配對。復(fù)制：A-T，C-G。轉(zhuǎn)錄：A-U，G-C，T-A。.

70．真核生物RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物和對鵝膏蕈堿的反應(yīng)。

（1）RNA-pol I：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：45S-rRNA 對鵝膏蕈堿的反應(yīng)：耐受。

（2）RNA-pol II：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：hnRNA ?對鵝膏蕈堿的反應(yīng):?極敏感。

（3）RNA-pol III：轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：5S-RNA, tRNA，snRNA. 對鵝膏蕈堿的反應(yīng)：中度敏感。

71. 轉(zhuǎn)錄：以DNA一條鏈為模板，以四種NTP為原料，在DNA指導(dǎo)的聚合酶作用下，按照堿基互補原則（ A-U,T-A,G-C）合成RNA鏈的過程。

72. 不對稱轉(zhuǎn)錄：轉(zhuǎn)錄時因為（1）DNA分子雙鏈一股鏈用作模板指引轉(zhuǎn)錄，另一股鏈不轉(zhuǎn)錄。

（2） 模板鏈并非總是在同一條鏈上。故稱為不對稱轉(zhuǎn)錄。

73. 原核生物聚合酶組成：由四種亞基組成α2ββ‘σ五聚體的蛋白質(zhì)。其中α2ββ’亞基稱為核心酶。σ因子辨認起始點。α決定哪些基因被轉(zhuǎn)錄。β起催化作用。β’起結(jié)合DNA模板（開鏈）作用。

74．操縱子：轉(zhuǎn)錄是不連續(xù)、分區(qū)段進行的。每一轉(zhuǎn)錄區(qū)段可視為一個轉(zhuǎn)錄單位，稱為操縱子。操縱子包括若干個結(jié)構(gòu)基因及其上游的調(diào)控序列。調(diào)控序列中的啟動子是RNA聚合酶結(jié)合模板DNA的部位，也是控制轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵部位。

75．電子顯微鏡下觀察到的羽毛狀的圖形說明：在同一DNA模板上，有多個轉(zhuǎn)錄同時在進行。在RNA鏈上觀察到的小黑點是多聚核蛋白體。轉(zhuǎn)錄和翻譯都在高效率的進行。

76．轉(zhuǎn)錄空泡：由酶-DNA-RNA形成的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。

77．依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止：

ρ因子是由相同亞基組成的六聚體，它是原核生物轉(zhuǎn)錄終止因子。可結(jié)合轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA 3‘端的多聚C特殊序列，還有ATP酶和解螺旋酶活性。ρ因子與轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物RNA 3‘端的多聚C結(jié)合后，ρ因子和RNA聚合酶都發(fā)生構(gòu)象改變，從而使RNA聚合酶停頓，解螺旋酶活性使DNA和RNA雜化雙鏈拆離，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物從轉(zhuǎn)錄復(fù)合物中釋放。

78．非依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止：

????RNA鏈延長至終止區(qū)時，轉(zhuǎn)錄出的堿基序列隨即形成莖－環(huán)結(jié)構(gòu)。這種二級結(jié)構(gòu)是阻止轉(zhuǎn)錄繼續(xù)向下游推進的關(guān)鍵。其機制有兩方面：一是莖環(huán)結(jié)構(gòu)在RNA分子形成可能改變RNA聚合酶的構(gòu)象。由于酶構(gòu)象的改變導(dǎo)致酶－模板結(jié)合方式的改變，可使酶不再向下游移動，于是轉(zhuǎn)錄停頓。其二，轉(zhuǎn)錄復(fù)合物（酶－DNA-RNA）上有局部的RNA/DNA雜化雙鏈。RNA分子和DNA分子都要形成自己的雙鏈，雜化鏈形成的機會不大，本來不穩(wěn)定的雜化鏈更不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)錄復(fù)合物趨于解體。接著一串寡聚U是使RNA鏈從模板脫落的促進因素，因為所有的堿基配對中以U和A的配對最不穩(wěn)定。

79．TFII的功能：

????TFIID：TBP（TATA結(jié)合蛋白）結(jié)合TATA盒。TAF（TBP輔助因子）輔助TBP-DNA結(jié)合。

????TFIIA：穩(wěn)定IID-DNA復(fù)合物。

????TFIIB：促進RNA-pol II結(jié)合及作為其他因子結(jié)合的橋梁。

????TFIIF: ?解螺旋酶

????TFIIE：ATPase

????TFIIH: 蛋白激酶活性。

80．轉(zhuǎn)錄起始前復(fù)合物（PIC）：是真核生物轉(zhuǎn)錄因子之間先互相辨認結(jié)合，然后以復(fù)合體的形式與RNA聚合酶一同結(jié)合于轉(zhuǎn)錄起始前的DNA區(qū)域而成。

81．真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄終止及加尾修飾

????真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄終止后，緊接著發(fā)生加尾修飾。過程如下:在模板鏈上轉(zhuǎn)錄終止點上游約百個或上千個核苷酸處常有一組共同的序列AATAAA。此序列后接著相當(dāng)多的GT序列。這些序列稱為轉(zhuǎn)錄終止的修飾點。轉(zhuǎn)錄越過修飾點后，mRNA在修飾點被切斷，隨即加入poly A尾及帽子結(jié)構(gòu)。下游的RNA雖然繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，但很快被RNA酶降解。因此有理由相信，帽子結(jié)構(gòu)是保護RNA免受降解的，因為修飾點以后的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物無帽子結(jié)構(gòu)。

82．外顯子：在斷裂基因及其初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上出現(xiàn)，并表達為成熟RNA的核酸序列。

83．內(nèi)含子：隔斷基因的線性表達而在剪接過程中被除去的核酸序列。

84．人類最龐大的一個基因是：抗肌萎縮蛋白基因。

85．剪接體：是由snRNP與hnRNA結(jié)合，使內(nèi)含子形成套索并拉近上下游外顯子距離的復(fù)合體。剪接體是mRNA剪接的場所。剪接過程的化學(xué)反應(yīng)稱為二次轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。

86．mRNA編輯：通過對mRNA中的加工，使遺傳信息在mRNA水平上發(fā)生改變。

87．tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工：

???（1）tRNA前體的剪接。先由核酸內(nèi)切酶進行催化進行剪切反應(yīng)，再由連接酶將外顯子連接起來。

???（2）加上3‘端CCA-OH。

???（3）化學(xué)修飾。包括：

甲基化反應(yīng)，使某些嘌呤變成甲基嘌呤。

還原反應(yīng)，使某些尿嘧啶還原成雙氫尿嘧啶（DHU）。

轉(zhuǎn)位反應(yīng)，尿嘧啶核苷轉(zhuǎn)變?yōu)榧倌蜞奏ず塑眨é担?/p>

脫氨反應(yīng)，某些腺苷酸脫氨成為次黃嘌呤核苷酸（I）。

88．rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工

????（1）rRNA前體的剪接。45S-rRNA經(jīng)剪接后，分出屬于小亞基的18S－rRNA，余下的部分再剪接成5.8S,28S?rRNA。rRNA成熟后，就在核仁上裝配，與核蛋白體蛋白質(zhì)一起形成核蛋白體，輸出胞漿。

????（2）化學(xué)修飾.主要是甲基化反應(yīng)。

89. 開放閱讀框架（ORF）：從mRNA?5‘端起始密碼子AUG到3’端終止密碼子之間的核苷酸序列，各個三聯(lián)體密碼連續(xù)排列編碼一個蛋白質(zhì)多肽鏈，稱為開放閱讀框架。

90．遺傳密碼的特點：

??（1）連續(xù)性。編碼蛋白質(zhì)氨基酸序列的各個三聯(lián)體密碼連續(xù)閱讀。

??（2）簡并性。除甲硫氨酸和色氨酸外，其他氨基酸都有2個或多個密碼子為之編碼，密碼子中第三位堿基是可以不同的，這稱為密碼子的簡并性。

??（3）通用性。蛋白質(zhì)生物合成的整套密碼，從原核生物到人類都通用。

??（4）擺動性。反密碼與密碼之間不嚴格遵守常見的堿基配對規(guī)律，尤其是密碼子的第三位堿基對反密碼子的第一位堿基，即使不嚴格配對也能辨認配對，這種現(xiàn)象稱為擺動配對。

91．原核生物翻譯起始復(fù)合物形成：

???（1）核蛋白體亞基分離。核蛋白體大小亞基分離。IF-1,IF-3與小亞基結(jié)合，促進大小亞基分離。

???（2）mRNA在小亞基定位結(jié)合。原核生物mRNA在小亞基定位涉及兩種機制。其一，在各種原核mRNA起始AUG上游約8－13核苷酸部位，存在4－9個核苷酸的一致序列，富含嘌呤堿基如AGGAGG，稱為S-D序列。而原核小亞基16S－rRNA的3‘端有一段富含嘧啶的段序列如UCCUCC，通過與S-D序列堿基配對使mRNA與小亞基結(jié)合。S-D序列又稱核蛋白體結(jié)合位點（RBS）。其二，mRNA上緊接S-D序列后的小核苷酸序列可被核蛋白體小亞基蛋白rpS-1識別結(jié)合。

???（3）起始氨基酰－tRNA的結(jié)合。起始fMet-tRNAifMet和GTP結(jié)合的IF-2一起，識別結(jié)合對應(yīng)小亞基P位的mRNA起始密碼AUG，起始時A位被IF-1占據(jù)，不與任何氨基酰－tRNA結(jié)合。

???（4）核蛋白體大亞基結(jié)合。上述結(jié)合mRNA、fMet-tRNAifMet的小亞基再與核蛋白體大亞基結(jié)合，同時IF－2結(jié)合的GTP水解釋能，促使3種IF釋放，形成由完整核蛋白體、mRNA、起始氨基酰－tRNA組成的翻譯起始復(fù)合物。此時，結(jié)合起始密碼AUG的fMet-tRNAifMet占據(jù)P位，而A位空留，對應(yīng)mRNA上AUG后的下一組三聯(lián)體密碼，準備相應(yīng)氨基酰－tRNA的進入。

92．肽鏈的延長。

??（1）進位。核糖體A位上mRNA密碼子所規(guī)定的氨酰－tRNA進入核糖體A位上稱為進位。這一過程需延長因子EF－T的參與。延長因子有三種：

????????1．EF-Tu.?功能：協(xié)助氨基酰－tRNA進入核糖體。與氨基酰－tRNA以及GTP結(jié)合形成EF-Tu-GTP-氨基酰-tRNA,將氨基酰-tRNA轉(zhuǎn)運到核糖體的A位。

????????2．EF-Ts. 功能：促進EF-Tu-GTP的再生。EF-Tu-GTP在參加一輪核糖體循環(huán)后轉(zhuǎn)變?yōu)镋F-Tu-GDP，EF-Ts使EF-Tu-GDP再轉(zhuǎn)變成EF-Tu-GTP，后者可被再利用。

????????3．EF-G. 功能：促進肽酰-tRNA移位。促進mRNA-肽酰-tRNA由A位移到P位，促進tRNA的釋放。

???(2) 成肽。在轉(zhuǎn)肽酶的催化下，P位上的肽?；cA位上的氨基?；呻模呻姆磻?yīng)在A位進行，卸載的tRNA仍在P位。

??（3）轉(zhuǎn)位。在轉(zhuǎn)位酶的催化下，新生肽鏈-tRNA連同mRNA從A位移到P位，而卸載的tRNA移入E位。A位空留并對應(yīng)下一組三聯(lián)體密碼。

93．終止因子：又稱釋放因子（RF）。其功能是識別mRNA上的終止密碼子，終止肽鏈的合成并釋放出肽鏈。原核生物中釋放因子是RF-1,RF-2,RF-3.?RF-1識別密碼子UAA及UAG，RF-2能識別UAA及UGA。RF-3結(jié)合GTP，并能促進RF-1,RF-2與核糖體結(jié)合。

94．原核肽鏈終止過程：肽鏈延長到mRNA終止密碼在核蛋白體A位出現(xiàn)，終止密碼子不能被任何氨基酰-tRNA識別進位。RF-1,RF-2進入A位，識別結(jié)合終止密碼。RF-1或RF-2任一釋放因子結(jié)合終止密碼后都可觸發(fā)核蛋白體構(gòu)象改變，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)肽酶轉(zhuǎn)變?yōu)轷ッ富钚?。使新生肽鏈與結(jié)合在P位的tRNA間酯鍵水解，將合成的肽鏈釋出。再促使mRNA、卸載tRNA及RF從核蛋白體脫離。RF-3有GTP酶活性，能介導(dǎo)RF-1,RF-2與核蛋白體的相互作用。

95．分子伴侶：分子伴侶是細胞中的一類保守蛋白質(zhì)，可識別肽鏈的非天然構(gòu)象，促進各功能域和整體蛋白質(zhì)的正確折疊。細胞中至少有兩類分子伴侶家族：熱休克蛋白和伴侶素。

96．蛋白質(zhì)合成后的加工：

??（1）新生肽鏈的折疊。

??（2）一級結(jié)構(gòu)的修飾。包括：肽鏈N端的修飾，個別氨基酸的修飾，多肽鏈的水解修飾。

??（3）空間結(jié)構(gòu)的修飾。包括：亞基聚合，輔基連接，疏水脂鏈的共價連接。

97．起始因子:

???(1) IF-1.能促進IF-2、IF-3的活化。

(2)?IF-2.促進fMet-tRNAifMet與30S小亞基結(jié)合的作用，并具有GTP酶活性。

(3) IF-3.功能是使30S亞基從不具活性的核糖體釋放，輔助mRNA與小亞基結(jié)合，并阻止大小亞基重新聚合。

98．信號假說機制：

這一假說認為，分泌性蛋白初級產(chǎn)物的N-端有信號肽結(jié)構(gòu)。在分泌性蛋白合成中，信號肽一出現(xiàn)，就被信號肽識別粒子與其受體對接蛋白結(jié)合，促使膜通道開放，信號肽帶動合成中的蛋白質(zhì)沿通道穿過膜，信號肽在沿通道折回膜內(nèi)時，被位于膜外側(cè)的信號肽酶切斷，使成熟的蛋白質(zhì)釋放到細胞外。

99．抗生素類作用位點：

四環(huán)素類：作用于核蛋白體小亞基，抑制氨基酰-tRNA與小亞基結(jié)合。

鏈霉素、卡那霉素：作用與核蛋白體小亞基，改變構(gòu)象引起讀碼錯誤。

氯霉素：作用與核蛋白體大亞基。抑制轉(zhuǎn)肽酶，阻斷延長。

紅霉素：作用與核蛋白體大亞基。抑制轉(zhuǎn)肽酶，妨礙轉(zhuǎn)位。

放線菌酮：作用與真核核蛋白體大亞基。抑制轉(zhuǎn)肽酶，阻斷延長。

嘌呤霉素：作用與真核、原核核蛋白體。屬氨基酰-tRNA類似物，進位后引起未成熟肽鏈脫落。

100．白喉毒素作用機制：

可使真核生物延長因子eEF-2發(fā)生ADP糖基化而失活。

?????干擾素作用機理：

（1）誘導(dǎo)特異蛋白激酶活化，該活化的激酶使真核主要的起始因子eIF2磷酸化失活，從而抑制病毒蛋白質(zhì)的合成。

（2）干擾素與雙鏈RNA共同活化2’-5’A合成酶，2’-5’A可活化核酸內(nèi)切酶RNaseL，后者使病毒mRNA降解，阻斷病毒蛋白質(zhì)合成。

101. 管家基因：有些基因產(chǎn)物對生命全過程都是必不可少的。這類基因在一個生物個體的幾乎所有細胞中持續(xù)表達，通常稱為管家基因。管家基因的表達水平受環(huán)境因素影響很小，而是在個體各個生長階段的大多數(shù)、或幾乎全部組織中持續(xù)表達，或變化很小。這類基因表達稱為基本（或組成性）基因表達。

102．誘導(dǎo)：可誘導(dǎo)基因在一定環(huán)境中表達增強的過程稱為誘導(dǎo)。

?????阻遏：可阻遏基因表達產(chǎn)物水平降低的過程稱為阻遏。

103．基因表達調(diào)控的生物學(xué)意義：

????（1）適應(yīng)環(huán)境、維持生長和增殖。

????（2）維持個體發(fā)育與分化。

104．原核生物轉(zhuǎn)錄的影響因素：

????（1）啟動子。啟動子決定轉(zhuǎn)錄的效率和方向。

????（2）σ因子。

????（3）阻遏蛋白具有負調(diào)控作用。

????（4）正調(diào)控蛋白促進基因的轉(zhuǎn)錄。

????（5）倒位蛋白通過DNA重組倒位而調(diào)節(jié)基因表達。倒位蛋白是一種位點特異性的重組酶。

????（6）RNA聚合酶抑制物可與RNA結(jié)合并抑制轉(zhuǎn)錄。

????（7）衰減子。

105．衰減子（attenuator）:細菌中mRNA轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)在一起的。這一特點使細菌中的一些操縱子的特殊序列可以在轉(zhuǎn)錄過程中控制轉(zhuǎn)錄水平。這些特殊序列稱為衰減子。

106．乳糖操縱子

????（1）乳糖操縱子的結(jié)構(gòu)：

含有Z、Y、A三個結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β－半乳糖苷酶、透酶和乙?；D(zhuǎn)移酶。此外，含有一個操縱基因O，一個啟動序列P，一個CAP結(jié)合位點和一個基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白，與操縱基因O結(jié)合。啟動序列P、操縱序列O和CAP結(jié)合位點組成乳糖操縱子的調(diào)控區(qū)。

????（2）阻遏蛋白的負性調(diào)控作用：

1．當(dāng)有乳糖存在時，乳糖通過β－半乳糖苷酶變?yōu)榘肴樘?，再?jīng)透酶進入細胞內(nèi)。真正的誘導(dǎo)劑是半乳糖而不是乳糖。乳糖可與阻遏蛋白結(jié)合，導(dǎo)致阻遏蛋白與操縱序列O解離，啟動基因轉(zhuǎn)錄。

2．當(dāng)沒有乳糖存在時，沒有誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合，阻遏蛋白與操縱序列O結(jié)合，發(fā)揮負性調(diào)控作用，基因不轉(zhuǎn)錄。

（3）CAP的正性調(diào)控作用：

1．當(dāng)沒有葡萄糖及cAMP濃度較高時，cAMP和CAP結(jié)合緊密，此時CAP結(jié)合在CAP結(jié)合位點，刺激RNA轉(zhuǎn)錄活性。

2．當(dāng)有葡萄糖存在及cAMP濃度較低時，cAMP和CAP結(jié)合受阻，因此lac操縱子表達下降。

（4）協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：

?????1．當(dāng)葡萄糖存在，乳糖存在時：盡管乳糖作為誘導(dǎo)劑和阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白與操縱序列O解離。但由于cAMP濃度較低，cAMP和CAP結(jié)合受阻，基因處于關(guān)閉狀態(tài)。

?????2．當(dāng)葡萄糖存在，乳糖不存在時：此時無誘導(dǎo)劑存在，阻遏蛋白與DNA結(jié)合。而且由于葡萄糖的存在，CAP也不能發(fā)揮正性調(diào)控作用，基因處于關(guān)閉狀態(tài)。

?????3．當(dāng)葡萄糖和乳糖都不存在時：CAP可以發(fā)揮正性調(diào)控作用，但由于沒有誘導(dǎo)劑，阻遏蛋白的負調(diào)控作用使基因仍處于關(guān)閉狀態(tài)。

4．當(dāng)葡萄糖不存在，乳糖存在時：此時CAP可以發(fā)揮正性調(diào)控作用，阻遏蛋白由于誘導(dǎo)劑的存在而失去復(fù)調(diào)控作用，基因被打開，啟動轉(zhuǎn)錄。

107．色氨酸操縱子調(diào)控機制：

????????(1)當(dāng)細胞內(nèi)色氨酸增多時，結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄受到抑制。衰減子轉(zhuǎn)錄物有4段特殊序列。片段1和2，2和3，3和4能配對形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，形成發(fā)夾能力的強弱依次為片段1/2>片段2/3>片段3/4。片段3/4所形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)之后緊接著寡尿嘧啶，是不依賴ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止信號。

(2)當(dāng)細胞內(nèi)有色氨酸存在時，形成色氨酰－tRNA，核糖體編譯可通過片段1并通過片段2，核糖體在到達片段3之前就從mRNA脫落。在這種情況下，片段1/2和片段2/3都不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，只有片段3/4形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，即形成轉(zhuǎn)錄終止信號，從而導(dǎo)致RNA聚合酶作用停止。

(3)當(dāng)細胞內(nèi)沒有色氨酸存在時，色氨酰－tRNA缺乏，核糖體停留在兩個相鄰的色氨酸密碼子的位置上，片段1/2不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，片段2/3之間形成形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，則片段3/4之間就不能形成轉(zhuǎn)錄終止信號，后面的基因得以轉(zhuǎn)錄。

108．SD序列：mRNA起始密碼子前的一段富含嘌呤核苷酸的核糖體結(jié)合位點。

109．原核翻譯水平的調(diào)控：

???（1）SD序列是影響翻譯的重要因素。

???（2）mRNA的穩(wěn)定性是調(diào)控翻譯的方式之一。

???（3）翻譯產(chǎn)物也可以對相應(yīng)mRNA的翻譯進行調(diào)控。

???（4）小分子RNA可以抑制特定mRNA的翻譯。

110．真核生物基因表達在DNA水平的調(diào)控主要通過下列幾種方式：

???（1）染色質(zhì)丟失。

???（2）基因擴增。

???（3）基因重排。

???（4）DNA甲基化。

???（5）染色質(zhì)結(jié)構(gòu)可影響基因表達。

111．反式作用因子：真核細胞內(nèi)有大量的序列特異的DNA結(jié)合蛋白，其中一些蛋白的主要功能是使基因開放或關(guān)閉，稱為反式作用因子。

112．轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物形成的步驟：

????（1）TFIID結(jié)合TATA盒。

????（2）RNA－pol識別并結(jié)合TFIID－DNA復(fù)合物。

????（3）其他轉(zhuǎn)錄因子與RNA－pol結(jié)合，轉(zhuǎn)錄起始部位的DNA解鏈，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物。

113．反式作用因子的特點：

????（1）一般具有三個功能結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄活性域和結(jié)合其他蛋白的結(jié)合域。

????（2）能識別并結(jié)合基因調(diào)控區(qū)中的順式作用元件。

????（3）對基因表達有正性和負性調(diào)控作用，即激活和阻遏基因的表達。

114．鋅指結(jié)構(gòu)：是指在結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域中含有較多的半胱氨酸(Cys)和組氨酸(His)的區(qū)域，借肽鏈的彎曲使2個Cys 和2個His或4個Cys與一個鋅離子絡(luò)合成的指狀結(jié)構(gòu)。

115．同源結(jié)構(gòu)域：許多反式作用因子結(jié)合DNA的結(jié)構(gòu)域中有一段相同的保守序列。是由60個左右的氨基酸組成的螺旋－回折－螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域，稱為同源結(jié)構(gòu)域。

116．亮氨酸拉鏈：有些反式作用因子結(jié)合DNA結(jié)構(gòu)域中有一段約30個氨基酸組成的核心序列，每隔6個氨基酸有規(guī)律的出現(xiàn)1個亮氨酸殘基，能形成兩性α-螺旋。在螺旋的一側(cè)是排列成行的亮氨酸，具有疏水性，稱為亮氨酸拉鏈區(qū)。兩個亮氨酸拉鏈區(qū)的單體以疏水作用形成亮氨酸拉鏈。

117．反式作用因子DNA結(jié)合域的結(jié)構(gòu)模式：

?（1）鋅指結(jié)構(gòu)。

?（2）同源結(jié)構(gòu)域。

?（3）亮氨酸拉鏈。

?（4）螺旋－環(huán)－螺旋結(jié)構(gòu)。

?（5）堿性α－螺旋。

118．轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)模型：

?（1）酸性α－螺旋結(jié)構(gòu)域

?（2）富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域

?（3）富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域。

119．mRNA的選擇性剪接方式

?（1）外顯子選擇方式可保留或部分保留外顯子。

?（2）內(nèi)含子選擇方式可刪除或部分刪除內(nèi)含子。

?（3）互斥外顯子是指兩個外顯子不能同時被保留。

?（4）內(nèi)部剪切位點造成內(nèi)含子或外顯子的部分序列被切除或保留。

120．翻譯起始的調(diào)控

?（1）阻遏蛋白的調(diào)控作用。

?（2）翻譯起始因子的功能調(diào)控。

?（3）5‘AUG對翻譯的調(diào)控作用。

?（4）mRNA非編碼區(qū)長度對翻譯的影響。

121．翻譯后水平的調(diào)控

?（1）新生肽鏈的水解。

?（2）肽鏈中氨基酸的共價修飾。

?（3）通過信號肽分揀、運輸、定位。

122.?同源重組：是指發(fā)生在同源序列間的重組，它通過鏈的斷裂和再連接，在兩個DNA分子同源序列之間進行單鏈或雙鏈片段的交換。又稱基本重組。

123．Holliday模型：

???(1)兩個同源染色體DNA排列整齊

???(2)一個DNA的一條鏈斷裂，并與另一個DNA對應(yīng)的鏈連接，形成Holliday中間體。

???(3)通過分支移動產(chǎn)生異源雙鏈DNA。

???(4)?Holliday中間體切開并修復(fù)，形成兩個雙鏈重組DNA。即片段重組體和拼接重組體。

124．細菌的基因轉(zhuǎn)移：細菌中，可以通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞融合四種方式，在不同DNA分子間發(fā)生共價連接，即基因轉(zhuǎn)移。

125．接合作用：當(dāng)細胞或細菌通過菌毛相互接觸時，質(zhì)粒DNA可以從一個細胞（細菌）轉(zhuǎn)移導(dǎo)另一個細胞（細菌），這種類型的DNA轉(zhuǎn)移稱為接合作用。

126．轉(zhuǎn)化作用：通過自動獲取或人為的供給外源DNA，使細胞或培養(yǎng)的受體細胞獲得新的遺傳表型，這就是轉(zhuǎn)化作用。

127．轉(zhuǎn)導(dǎo)作用：當(dāng)病毒從被感染的細胞（供體）釋放出來，再次感染另一細胞（受體）時，發(fā)生在供體細胞和受體細胞之間的DNA轉(zhuǎn)移及基因重組即為轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。自然界常見的例子就是噬菌體感染宿主時伴隨發(fā)生的基因轉(zhuǎn)移。當(dāng)噬菌體感染宿主時會有兩種結(jié)局，一是溶菌生長途徑，二是溶源菌生長途徑。

128．特異位點重組：由整合酶催化，在兩個DNA序列的特異位點之間發(fā)生的整合稱為位點特異的重組。

129．重組DNA常用的工具酶

????1．限制性核酸內(nèi)切酶：識別特異序列，切割DNA。

???2．DNA連接酶

???3．DNA聚合酶I。具有完整的5’-3’聚合，3’-5’外切活性，以及?5’-3’外切活性。用枯草桿菌蛋白酶可將DNA聚合酶I裂解成兩個片段，大片段稱為Klenow片段。具有5’-3’聚合，3’-5’外切活性，無5’-3’外切活性。

Klenow片段用途：

???（1）在cDNA克隆中，第二股鏈的合成。

???（2）DNA序列分析。

???（3）補齊雙鏈DNA的3’端。

???（4）通過補齊3’端，使3’端標(biāo)記。

???4．逆轉(zhuǎn)錄酶。

???5．堿性磷酸酶。能去除末端磷酸基。

???6．末端轉(zhuǎn)移酶。在3＇羥基末端進行同聚物加尾。

???7．多聚核苷酸激酶。催化多聚核苷酸5’羥基磷酸化，或標(biāo)記探針。

130．限制性核酸內(nèi)切酶：就是識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。

131．回文結(jié)構(gòu)：大部分II類限制性核酸內(nèi)切酶識別DNA位點的核苷酸序列呈二元旋轉(zhuǎn)對稱，通常稱這種特殊結(jié)構(gòu)順序為回文結(jié)構(gòu)。

132．C值 ：基因組的大小常以其DNA含量表示。單倍體基因組中的全部DNA量稱為C值。

133．作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備：

???（1）分子量相對較小，能在細菌中穩(wěn)定存在，有較高的拷貝數(shù)。

???（2）具有一個以上的遺傳標(biāo)志。

???（3）具有多個限制性內(nèi)切酶的單一切點，便于外源基因的插入。

134．常用作克隆的載體：質(zhì)粒、λ噬菌體、M13噬菌體、粘性質(zhì)粒、病毒載體、酵母人工染色體和細菌人工染色體。

135．DNA克隆：應(yīng)用酶學(xué)的方法，在體外將各種來源的遺傳物質(zhì)與載體結(jié)合成一具有自我復(fù)制能力的DNA分子――復(fù)制子，繼而通過轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞，篩選出含有目的基因的轉(zhuǎn)化子細胞，再進行擴增、提取獲得大量同一DNA分子，即DNA克隆。又稱基因克隆。實現(xiàn)基因克隆所采用的方法及相關(guān)工作稱為基因工程或重組DNA技術(shù)。

136．基因克隆的步驟：

???（1）目的基因的獲取。

?????1．化學(xué)合成法。

?????2．基因組DNA文庫。

?????3．cDNA文庫。

?????4．PCR。

???（2）克隆載體的選擇和構(gòu)建。

???（3）外源基因和載體的連接。

?????1．粘性末端連接。

?????2．平端連接。

?????3．同聚物加尾連接。

?????4．人工街頭連接。

???（4）重組DNA導(dǎo)入受體細胞。

?????1．轉(zhuǎn)化：是指將質(zhì)?；蚱渌庠碊NA導(dǎo)入處于感受態(tài)的宿主菌，并使其獲得新的表型的過程。

?????2．感染：λ噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細胞病毒為載體的重組DNA分子，在體外包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，然后才能感染適當(dāng)?shù)募毎?，并在細胞?nèi)擴增。

3．轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染是轉(zhuǎn)化和感染兩個詞構(gòu)成的新詞，指真核細胞主動攝取或被動導(dǎo)入外源DNA片段而獲得新的遺傳表型的過程。常用方法有：電穿孔法、磷酸鈣共沉淀法和脂質(zhì)體融入法等。

（5）重組體的篩選。

???1．遺傳學(xué)方法

???2．免疫學(xué)方法

???3．核酸雜交法

???4．PCR技術(shù)

???5．酶切鑒定

（6）克隆基因的表達

137．真核細胞轉(zhuǎn)染的方法：

（1）磷酸鈣共沉淀法

?????(2) 電穿孔法

（3）DEAE－葡聚糖法

（4）脂質(zhì)體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染

（5）顯微注射法

138．重組DNA技術(shù)應(yīng)用

（1）疾病基因的發(fā)現(xiàn)和克隆

（2）生物制藥

（3）基因診斷

（4）基因治療

（5）遺傳病的預(yù)防

139.?細胞間信息物質(zhì)（第一信使）：凡由細胞分泌的調(diào)節(jié)靶細胞生命活動的化學(xué)物質(zhì)統(tǒng)稱細胞間信息物質(zhì)。包括：神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌激素、局部化學(xué)介質(zhì)和氣體信號。

140．細胞內(nèi)信息物質(zhì)：在細胞內(nèi)傳遞細胞調(diào)控信號的化學(xué)物質(zhì)稱為細胞內(nèi)化學(xué)物質(zhì)。

141．第二信使：通常將Ca2+、cAMP、cGMP、DAG、IP3、Cer、花生四烯酸及其代謝產(chǎn)物這類在細胞內(nèi)傳遞信息的小分子化合物稱為第二信使。

142．第三信使：負責(zé)細胞核內(nèi)外信息傳遞的物質(zhì)稱為第三信使。是一類可與靶基因特異序列結(jié)合的核蛋白，能調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，因此又稱為DNA結(jié)合蛋白。

143．膜受體分為：環(huán)狀受體、G蛋白偶聯(lián)受體、單次跨膜α螺旋受體和具有鳥苷酸環(huán)化酶活性的受體。

144．胞內(nèi)受體包括四個區(qū)域：高度可變區(qū)、DNA結(jié)合區(qū)、鉸鏈區(qū)和激素結(jié)合區(qū)。

145．受體與配體結(jié)合的特點：高度專一性、高度親和力、可飽和性、可逆性和特定的作用模式。

146．膜受體介導(dǎo)的信息轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑

(1)cAMP－蛋白激酶途徑。

1．cAMP的生成與降解。一些激素如腎上腺素、胰高血糖素等作用于相應(yīng)的受體后，活化相應(yīng)的受體，活化的受體可催化Gs的GDP與GTP交換，導(dǎo)致Gs的α亞基與βγ解離，釋放出αs－GTP，αs－GTP可導(dǎo)致AC活化，使得ATP轉(zhuǎn)變?yōu)閏AMP，細胞內(nèi)cAMP濃度升高。

??cAMP在細胞內(nèi)的濃度除與AC活性相關(guān)，還和磷酸二酯酶活性有關(guān)。

2．cAMP的作用機制。cAMP對細胞的調(diào)節(jié)作用是通過激活cAMP依賴性蛋白激酶系統(tǒng)來實現(xiàn)的。PKA是一種由四聚體組成的別構(gòu)酶（C2R2）.其中C為催化亞基，R為調(diào)節(jié)亞基。每個調(diào)節(jié)亞基上有兩個cAMP結(jié)合位點，催化亞基有催化底物蛋白質(zhì)特定絲/蘇氨酸殘基磷酸化的功能。調(diào)節(jié)亞基與催化亞基結(jié)合時，PKA呈無活性狀態(tài)。當(dāng)4分子cAMP與兩分子調(diào)節(jié)亞基結(jié)合后，調(diào)節(jié)亞基脫落，游離的催化亞基具有蛋白激酶活性。

3．PKA的作用。PKA被cAMP激活后，能在ATP存在的情況下使許多蛋白質(zhì)特定的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，從而調(diào)節(jié)細胞的物質(zhì)代謝和基因表達。

對代謝的調(diào)節(jié)作用：腎上腺素調(diào)節(jié)糖原分解的級聯(lián)反應(yīng)。腎上腺素與質(zhì)膜上的受體結(jié)合后，通過激動型G蛋白使AC活化，AC激活A(yù)TP生成cAMP。后者進一步激活PKA，PKA一方面使無活性的磷酸化酶激酶b磷酸化為有活性的磷酸化酶激酶b，后者能催化磷酸化酶b成為有活性的磷酸化酶a.?磷酸化酶a經(jīng)磷蛋白磷酸酶脫去磷酸又轉(zhuǎn)變?yōu)闊o活性的磷酸化酶b。磷蛋白磷酸酶活性也受PKA的調(diào)節(jié)。同時，PKA也使有活性的糖原合酶的特定絲/蘇氨酸殘基磷酸化轉(zhuǎn)變成無活性。

對基因表達的調(diào)節(jié)作用:在基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)有一類cAMP應(yīng)答元件（CRE），它可與cAMP應(yīng)大元件結(jié)合蛋白（CREB）相互作用而調(diào)節(jié)此基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)PKA的催化亞基進入細胞核后，可催化反式作用因子－CREB中特定的絲/蘇氨酸殘基磷酸化。磷酸化的CREB與DNA上的CRE結(jié)合，從而激活受CRE調(diào)控的基因轉(zhuǎn)錄。

（2）Ca2+-依賴性蛋白激酶途徑

1．Ca2+-磷脂依賴性蛋白激酶途徑

IP3和DAG的生物合成和功能：去甲腎上腺素等激素作用于靶細胞膜上相應(yīng)的受體后，通過Gp激活PI-PLC，后者可水解PIP2而生成DAG和IP3。DAG生成后仍留在質(zhì)膜上，在磷脂酰絲氨酸和Ca2+的配合下激活PKC。IP3生成后，從膜中擴散到胞漿中與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和肌漿網(wǎng)上的受體結(jié)合，促進這些鈣儲存庫內(nèi)Ca2+?的釋放，Ca2+能與胞漿內(nèi)的PKC結(jié)合并聚集到質(zhì)膜，在DAG和膜磷脂共同誘導(dǎo)下，PKC被激活。

PKC的生理功能：對代謝的調(diào)節(jié)作用和對基因表達的調(diào)節(jié)作用。

2．Ca2+-鈣調(diào)蛋白依賴性途徑

鈣調(diào)蛋白為鈣結(jié)合蛋白，人體的CaM有4個Ca2+結(jié)合位點，這些位點被占滿后其構(gòu)象發(fā)生改變。當(dāng)胞漿內(nèi)Ca2+濃度高到10-2mmol/L時，Ca2+與CaM結(jié)合。Ca2+－CaM底物譜很廣，可以磷酸化許多蛋白質(zhì)的絲/蘇氨酸殘基，使之激活或失活。Ca2+－CaM既可以激活腺苷酸環(huán)化酶又可以激活磷酸二酯酶，使它既加速cAMP的生成又加速cAMP的講解，使信息迅速傳到細胞內(nèi)，又迅速消失。Ca2+－CaM在細胞的信號傳遞中也起著重要作用。

（3）cGMP-蛋白激酶系統(tǒng)

cGMP由GTP在鳥苷酸環(huán)化酶的催化下生成，經(jīng)磷酸二酯酶催化而降解。心鈉素（ANP）與靶細胞膜上具有鳥苷酸環(huán)化酶活性的受體結(jié)合后，能激活鳥苷酸環(huán)化酶，后者催化GTP轉(zhuǎn)變?yōu)閏GMP。cGMP能激活cGMP依賴性蛋白激酶G（PKG），催化有關(guān)蛋白絲/蘇氨酸殘基磷酸化，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，即松弛血管平滑肌和增加尿鈉，還可以降低血壓。

（4）酪氨酸蛋白激酶體系

1．受體型TPK-Ras-MAPK途徑：受體與配體結(jié)合后，發(fā)生自身磷酸化和磷酸化GRB2和SOS。磷酸化的受體與GRB2－SOS復(fù)合物結(jié)合，進而激活Ras蛋白。Ras蛋白又稱小G蛋白，性質(zhì)類似與G蛋白中的Gα亞基，它的活性和其結(jié)合GTP或GDP直接有關(guān)，Ras與GDP結(jié)合時無活性，與GTP結(jié)合而活化?；罨腞as蛋白可進一步活化Raf蛋白。Raf蛋白具有絲/蘇氨酸蛋白激酶活性，它可進一步激活有絲分裂原激活蛋白激酶（MAPK）系統(tǒng)。MAPK系統(tǒng)包括MAPK、MAPKK、MAPKKK，MAPK更具廣泛的催化活性，它既能催化絲/蘇氨酸殘基又能催化酪氨酸殘基磷酸化，故是具雙重催化活性的蛋白激酶。MAPK除調(diào)節(jié)花生四烯酸代謝和細胞微管形成外，更重要的是可催化細胞核內(nèi)許多反式作用因子的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄或關(guān)閉。受體型TPK活化后還可通過激活A(yù)C，多種磷脂酶等發(fā)揮調(diào)控基因的作用。

2．JAKs-STAT途徑

一部分生長因子和大部分細胞因子可借助細胞內(nèi)非受體型酪氨酸蛋白激酶JAKs完成信息傳導(dǎo)。JAKs再通過激活STAT影響基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。

（5）核因子κB途徑

主要涉及機體的防御反應(yīng)、組織損傷和應(yīng)激、細胞分化和凋亡以及腫瘤生長抑制過程的信息傳遞。

（6）TGF-β途徑

調(diào)節(jié)增殖、分化、遷移和凋亡等多種細胞反應(yīng)。

147.雙脫氧鏈終止法測序的基本原理：

和模版互補結(jié)合的引物在DNA聚合酶（通常是DNA聚合酶I的大片段Klenow或T7DNA聚合酶）作用下發(fā)生互補鏈的延伸反應(yīng)，反應(yīng)體系中的2’-3’-雙脫氧鏈核苷三磷酸(ddNTP)與底物脫氧核苷三磷酸(dNTP)競爭結(jié)合與延伸互補鏈末端，造成延伸終止。由于產(chǎn)生一系列分別終止于A、G、T、C位置的不同大小的DNA末端，應(yīng)用高分辨率聚丙烯酰胺凝膠電泳可分辨僅相差一個核苷酸的20－500堿基的DNA片段，結(jié)合放射自顯影技術(shù)，便可直接讀出模板DNA的待測序列。

148．化學(xué)裂解法測序原理：

采用化學(xué)試劑處理末端放射性標(biāo)記的DNA單鏈片段，造成堿基非特異性切割，由此產(chǎn)生一組具不同長度的DNA鏈的反應(yīng)混合物，經(jīng)凝膠電泳按分子大小分離和放射自顯影，直接讀出待測DNA的核苷酸順序。

149．大片段DNA序列測定的策略：隨機法、嵌套缺失法、引物延伸法。

150．核酸分子雜交：是指具有互補序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基配對原則形成雙鏈的過程。

151．核酸分子雜交的原理：具有互補序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下（適宜的溫度及離子強度）堿基互補配對結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化，以及復(fù)性過程中各分子間鍵的形成和斷裂等。雜交的雙方是待測核酸序列和已知核酸序列。在雜交體系中已知的核酸序列稱作探針，探針通常用于進行核素或非核素標(biāo)記。

152．DNA變性：在物理或化學(xué)因素作用下，，可以導(dǎo)致兩條DNA鏈之間的氫鍵斷裂，而核酸分子中所有的共價鍵不受影響，稱為DNA變性。

153．導(dǎo)致DNA變性的方法：熱變性、酸堿變性、化學(xué)試劑變性。

153. Tm值：雙鏈DNA變性一半所需要的溫度稱作DNA的溶解溫度。

154．復(fù)性：兩條互補的單鏈DNA分子在變性條件除去后能重新按堿基互補配對原則以氫鍵相連形成雙鏈DNA分子，這一過程稱為DNA復(fù)性。

155．影響雜交的因素：

1．核酸分子的濃度和長度

2．溫度

3．離子強度

4．雜交液中的甲酰胺

5．核酸分子的復(fù)雜性

6．非特異性雜交反應(yīng)

156．FISH(熒光原位雜交)：是一種非放射性原位雜交方法，用特殊熒光標(biāo)記核酸探針，可在染色體、細胞和組織切片上進行DNA雜交，能夠非常有效地檢測細胞內(nèi)是否存在特定的DNA或RNA序列。

157．Southern Blotting步驟：

1．待測核酸樣品的制備。包括制備待測DNA和DNA的限制酶消化。

2．待測DNA樣品的電泳分離。

3．凝膠中核酸的變性。

4．Southern轉(zhuǎn)膜。常用的轉(zhuǎn)膜方法：毛細管虹吸印跡法、電轉(zhuǎn)印法、真空轉(zhuǎn)移法。

5．探針的制備

6．Southern雜交。必須先進行預(yù)雜交。

7．雜交結(jié)果的檢測。

158：預(yù)雜交：能夠結(jié)合DNA片段的膜同樣能夠結(jié)合探針DNA，在進行雜交前必須將膜上所有能與DNA結(jié)合的位點全部封閉，這就是預(yù)雜交的目的。

159．Southern Blotting：是指DNA與DNA的雜交，將電泳分離的待測DNA片段轉(zhuǎn)印并結(jié)合與一定的固相支持物上，然后用標(biāo)記的DNA探針檢測待測DNA的一種方法。

160．Northern Blotting:是指將待測RNA樣品經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后與標(biāo)記的核酸探針進行固－液相雜交，檢測RNA（主要是mRNA）的方法。

161．斑點印跡：將RNA或DNA變性后直接點樣于硝酸纖維素膜上或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達的定性及定量研究，稱為斑點印跡（Dot Blot）.

162.?原位雜交：核酸保持在細胞或組織切片中，經(jīng)適當(dāng)方法處理細胞或組織后，將標(biāo)記的核酸探針與細胞或組織中的核酸進行雜交，稱為原位雜交。

163．原位雜交的步驟：

1．組織或細胞的固定

2．組織細胞雜交前的預(yù)處理。一般用去垢劑（Triton X－100、SDS）或蛋白酶消化。

3．探針的選擇和標(biāo)記

4．雜交

5．雜交結(jié)果檢測

164．液相雜交：是指待測核酸分子與核酸探針都存在與雜交液中，堿基互補的單鏈核酸分子在液體中配對形成雜交分子，常用的液相雜交有RNA酶保護分析法、核酸酶S1保護分析法。

165．RNA酶保護分析法：是利用RnaseA和RnaseT1能專一性降解單鏈RNA而雙鏈RNA則受到保護的特點，用放射性標(biāo)記的RNA探針與待檢mRNA進行液相雜交，使互補序列RNA探針和待測RNA形成雜交體。此法用于mRNA定量、mRNA末端定位及確定內(nèi)含子在相應(yīng)基因中的位置等。RPA的基本程序：

1．制備待測RNA

2．RNA探針的標(biāo)記

3．雜交

4．除去單鏈RNA

5．電泳分析

166．探針的種類：cDNA探針、基因組DNA探針、寡核苷酸探針、RNA探針

167．標(biāo)記物：

（1）核素標(biāo)記物：32P、35S等，以32P最常用。

（2）非核素標(biāo)記物：半抗原、配體、熒光素、化學(xué)發(fā)光探針。

168．標(biāo)記方法：缺口平移法、隨機引物法、PCR法、末端標(biāo)記法

169．探針的純化方法：乙醇沉淀法、Sephadex G-50柱層析法、微柱離心法

170．缺口平移法原理：利用適當(dāng)濃度的DNaseI在DNA雙鏈上隨即切割單鏈，造成單鏈切口。切口處產(chǎn)生一個5’端和一個3’端，3’端即可作為引物，在DNA聚合酶I的5’-3’DNA聚合酶活性催化下，以互補的DNA單鏈為模版，依次將dNTP結(jié)合到切口的3’端，合成新的DNA單鏈；同時DNA聚合酶I的5’-3’核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5’逐步切除，新合成鏈不斷延伸，從而使原DNA分子上的部分核苷酸殘基被標(biāo)記的核苷酸所取代。

171．隨機引物法原理：隨機引物是人工合成的長度為6個核苷酸殘基的寡聚核苷酸片段的混合物，它們的順序是根據(jù)計算機分析了生物基因組DNA六核苷酸排列的多種可能性而設(shè)計的。對于任意一個用作探針的DNA片段，隨機引物混合物都有一些核苷酸片段與之結(jié)合，起到DNA合成引物的作用。將這些隨機引物與變性后的DNA單鏈結(jié)合，然后以此結(jié)合的隨機引物為引物，以變性后的單鏈DNA為模版，在Klenow酶的催化下，以四種dNTP（其中一種為標(biāo)記物標(biāo)記的DNA探針）為底物，合成與探針互補的且?guī)в袠?biāo)記物的DNA探針。

172．PCR的原理：

PCR是一種體外擴增DNA的技術(shù)，基本原理是：作為引物的一對寡核苷酸與模板DNA同源序列按照堿基互補配對原則形成局部雙鏈，然后在Taq DNA聚合酶作用下引導(dǎo)新鏈DNA的合成，一般經(jīng)25－30個變性、退火、延伸的循環(huán)，可以獲得特異性PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系包括：耐熱的Taq DNA聚合酶、化學(xué)合成的寡核苷酸引物、4種dNTP、合適的緩沖液體系、模板DNA。

173．引物設(shè)計的原則：

1．引物長度一般為15－30個核苷酸

2．兩個引物之間不應(yīng)該存在互補序列

3．引物本身不應(yīng)存在互補序列

4．引物與非特異性擴增區(qū)序列的同源性不應(yīng)超過70％，引物的3’端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)外不應(yīng)有互補序列

5．引物的5’端最多可以游離10幾個堿基而不影響反應(yīng)的進行

6．引物堿基組成應(yīng)隨機分布，應(yīng)避免嘌呤或嘧啶的堆積，特別是引物的3’端不應(yīng)有連續(xù)3個G和C。

7．引物的3’端一定要與模版配對。

174．PCR到達平臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于：樣品模版的拷貝數(shù)、PCR的擴增效率以及DNA聚合酶的種類和活性，以及非特異性產(chǎn)物的競爭。到達平臺期前，一般要進行25次以上的循環(huán)。

175．PCR反應(yīng)注意事項：

1．隔離不同操作區(qū)，包括樣品制備區(qū)、PCR操作區(qū)和反應(yīng)產(chǎn)物分析區(qū)

2．嚴格實驗操作

3．設(shè)立實驗對照：陽性對照、陰性對照、試劑對照

176．筑巢PCR：先用一對外側(cè)引物擴增含目的基因的大片段，再用一對內(nèi)側(cè)引物以大片段為模板擴增獲取目的基因。筑巢PCR可以提高PCR的效率和特異性。

177．多重PCR：是在一次反應(yīng)中加入多對引物，同時擴增一份DNA樣品中不同序列的PCR過程。由于每對引物擴增區(qū)位于模板DNA的不同部位，因而擴增片段長短不同。由此檢測是否存在某些基因片段的缺失或突變。

178．共享引物PCR：是利用3條引物擴增兩種不同的DNA序列，其中一條引物與兩種待擴序列都互補，它與另兩條引物分別組成兩對PCR引物。這種PCR方法常用于細菌學(xué)鑒定，確定同一種屬細菌的不同種類。

179．原位PCR:以組織固定處理細胞內(nèi)的DNA或RNA為靶序列，進行PCR反應(yīng)的過程，稱為原位PCR。原位PCR不需從組織細胞中分離模板DNA或RNA。原位PCR成為靶基因序列的細胞定位、組織分布和靶基因表達檢測的重要手段。

180．RT－PCR：是將RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。首先用RNA為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成cDNA，再以cDNA為模版通過PCR反應(yīng)來擴增目的基因。RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因以及對已知序列的RNA進行定性定量分析的最有效方法之一。

181．實時PCR（Real time PCR）:?Real time PCR的基本原理是引入了熒光標(biāo)記分子，使得在PCR反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光信號與PCR產(chǎn)物量成正比，對每一反應(yīng)時刻的熒光信號進行實時分析，計算出PCR模版DNA的含量。探針的5’端有一個熒光報告分子，3’端有一個熒光淬滅分子。沒有擴增反應(yīng)時，探針保持完整，無熒光信號釋放。隨著PCR的進行，TaqDNA聚合酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的熒光探針，其5’-3’外切核酸酶就會將該探針逐步切斷，報告熒光基團一旦與淬滅基團分離，便產(chǎn)生熒光信號。后者被熒光檢測系統(tǒng)接收，用于數(shù)據(jù)分析。

182．基因組DNA文庫的構(gòu)建：

基因組DNA文庫是指包含某一個生物細胞全部基因組DNA序列的克隆群體，它以DNA片段的形式貯存著某一生物的全部基因組DNA信息。

基因組DNA文庫的構(gòu)建過程：將純化的細胞基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化，獲得一定大小的DNA片段，將這些片段克隆到噬菌體載體中，從而獲得一群含有不同DNA片段的噬菌體，這就是基因組DNA文庫。

183．cDNA文庫及構(gòu)建：

cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列的克隆群體，它以cDNA片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。

cDNA文庫的構(gòu)建：將組織細胞中的mRNA經(jīng)過反轉(zhuǎn)錄合成從cDNA，后者被克隆進入質(zhì)粒或噬菌體載體，轉(zhuǎn)化宿主細胞后可獲得克隆群體。

184.轉(zhuǎn)基因動物：是指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi)，并能穩(wěn)定傳代的一類動物。

185．導(dǎo)入基因的主要方式：顯微注射法、胚胎干細胞法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法。

186．基因打靶的必備條件：胚胎干細胞、打靶載體

187．打靶載體的篩選標(biāo)志：neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志；HSV-tk陰性篩選標(biāo)志。

188．基因敲除的基本程序：

1．打靶載體的構(gòu)建

2．打靶載體導(dǎo)入ES細胞

3．基因敲除ES細胞注射入胚泡

4．胚泡植入假孕小鼠的子宮中

5．嵌合體的雜交育種

189．構(gòu)建打靶載體的基本過程

1．獲得目的基因的同源片段，將此DNA片段克隆到一般的質(zhì)粒載體中

2．從重組質(zhì)粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在線性質(zhì)粒載體的兩端

3．將neo基因克隆到帶有目的基因同源順序的線性質(zhì)粒中，使之位于殘留目的基因同源順序的中間

4．在目的基因同源順序的外側(cè)線性化重組質(zhì)粒載體，將HSV-tk基因克隆到此線性載體中

190．DNA芯片技術(shù)：是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達的信息）。由于常用計算機硅芯片作為固相支持物，所以稱為DNA芯片。

191．DNA芯片可分為：原位合成芯片和DNA微集陣列

192．原位合成芯片：采用顯微光蝕刻等技術(shù)在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片稱為原位合成芯片。

193．DNA微集陣列：將預(yù)先制備的DNA片段以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面而制成的芯片稱為DNA微集陣列。

194.DNA芯片技術(shù)的方法主要包括芯片的制備、樣品的制備、分子雜交和檢測分析。

195．原位合成芯片是采用顯微光蝕刻或壓電打印技術(shù)。

196．DNA芯片技術(shù)的應(yīng)用：DNA序列測定、基因表達分析、基因組研究、基因診斷、藥物研究與開發(fā)

197．癌基因：是細胞內(nèi)控制細胞生長的基因，具有潛在的誘導(dǎo)細胞惡性轉(zhuǎn)化的特性。癌基因表達異常時，其產(chǎn)物可使細胞無限制分裂。癌基因包括細胞癌基因和病毒癌基因。

198．原癌基因：正常細胞內(nèi)未被激活的癌基因稱為原癌基因。

199．病毒癌基因與細胞癌基因的比較：

相同之處：兩者結(jié)構(gòu)十分相似、序列上存在一定程度同源性、產(chǎn)物也基本相似。

不同之處：

1．病毒癌基因與細胞癌基因相比，通常丟失了兩端的某些序列。

2．病毒癌基因沒有內(nèi)含子，而細胞癌基因中通常含有內(nèi)含子或插入序列。

3．病毒癌基因與同源的細胞原癌基因在外顯子序列中也有微小的差別。

4．病毒癌基因常會出現(xiàn)堿基取代或堿基缺失等突變，而細胞癌基因則較少發(fā)現(xiàn)這一類病變。

200．癌基因家族包括：src家族、ras家族、myc家族、sis家族、erb家族

201．抑癌基因：是指存在于正常細胞中的一大類可抑制細胞生長并具有潛在抑癌作用的基因，當(dāng)這類基因發(fā)生突變、缺失或失活時可引起細胞惡性轉(zhuǎn)化而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

201．癌基因表達產(chǎn)物：

1．細胞外的生長因子

包括生長因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、藥物等

2．跨膜的生長因子受體

3．核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子

4．非受體酪氨酸蛋白激酶

5．G蛋白

202．癌基因的活化機制：

1．點突變

2．基因重排

3．原癌基因擴增

4．獲得啟動子與增強子

5．染色體易位

203．基因診斷常用的技術(shù)

1. 核酸分子雜交

2．PCR

3．DNA序列測定

4．DNA芯片技術(shù)

5．限制酶酶譜分析

6．單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測

204．單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）：DNA經(jīng)變性形成單鏈后，在中性條件下單鏈DNA會因其分子內(nèi)堿基之間的相互作用，形成一定的立體構(gòu)象。相同長度的單鏈DNA，如果堿基組成和(或)排列順序不同，形成的構(gòu)象就不同，這就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性。

205.基因診斷的應(yīng)用

1．對遺傳病的防治

2．對腫瘤進行診斷

3．感染性疾病的基因診斷

4．傳染性疾病的診斷

5．對重大疾病易感性的診斷

6．器官移植配型

7．法醫(yī)學(xué)的應(yīng)用

206．基因診斷的特點

1．以基因作為檢查材料和探查目標(biāo)，屬于“病因診斷”，針對性強。

2．分子雜交技術(shù)選用特定基因序列作為探針，具有很高特異性。

3．由于分子雜交和PCR技術(shù)都具有放大效應(yīng)，故診斷靈敏度很高

4．適用性強，診斷范圍廣。

207．限制酶酶譜分析

此方法是利用限制性內(nèi)切酶和特異性DNA探針來檢測是否存在基因變異。當(dāng)待測DNA序列中發(fā)生突變時會導(dǎo)致某些限制性內(nèi)切酶位點的突變，則其限制酶酶切片段的大小或多少在電泳遷移率上也會隨之改變，借此可作出分析診斷。

208．DNA限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）

不少DNA多態(tài)性發(fā)生在限制性內(nèi)切酶識別位點上，酶切水解該DNA片段就會產(chǎn)生長度不同的片段，稱為限制性片段長度多態(tài)性。

209．等位基因特異寡核苷酸探針（ASO）雜交法

根據(jù)已知基因突變位點的核苷酸序列，人工合成兩種寡核苷酸探針，一種是相應(yīng)于突變基因堿基序列的寡核苷酸(M)，一種是相應(yīng)于正?；驂A基序列的寡核苷酸(N)，用它們分別與受檢者DNA進行分子雜交。若受檢者DNA能與M雜交，而不能與N雜交，說明受檢者是這種突變的純合子；若受檢者DNA既能和M雜交也能和N雜交，說明受檢者是這種突變的雜合子；若受檢者不能與M雜交，但能與N雜交，說明受檢者不存在這種突變基因；如果受檢者和M、N均不結(jié)合，說明缺陷基因可能是一種新的突變類型。

210.基因治療的方法:

1. 基因矯正：將致病基因的異常堿基進行糾正，而正常部分予以保留

2．基因置換：用正常的基因通過體內(nèi)基因同源重組，原位替換病變細胞內(nèi)的致病基因，使細胞內(nèi)的DNA完全恢復(fù)正常狀態(tài)。

3．基因增補：將目的基因?qū)氩∽兗毎蝗コ惓；?，而是通過目的基因的非定點整合，使其表達產(chǎn)物補償缺陷基因的功能或使原有的功能得到增強。

4．基因失活：是將特定的序列導(dǎo)入細胞后，在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平阻斷某些基因的異常表達，以達到治療疾病的目的。包括反義RNA技術(shù)、核酶、三鏈技術(shù)和干擾RNA技術(shù)。

211．基因治療的基本程序：

1．治療性基因的選擇

2．基因載體的選擇

3．靶細胞的選擇

4．基因轉(zhuǎn)移

5．外源基因表達的篩檢

6．回輸體內(nèi)

212．單核苷酸多態(tài)性(SNP):是指出現(xiàn)在基因組DNA分子的特定位置的單個核苷酸的置換。

213．RNAi（RNA干涉）：是指由短雙鏈DNA誘導(dǎo)的同源mRNA的降解過程，可使基因的表達受到抑制。

214．RNA干涉原理、步驟和應(yīng)用：

原理：雙鏈RNA 激活Dicer（?酶復(fù)合物，由核酸內(nèi)切酶和解旋酶組成），識別異常的雙鏈RNA并將其切割成短雙鏈RNA（siRNA，21-23bp），?siRNA與Dicer結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RISC），雙鏈RNA經(jīng)解旋酶作用，成為單鏈RNA，識別并結(jié)合靶RNA分子，致核酸內(nèi)切酶的切割，失去編碼蛋白質(zhì)的功能。

步驟：1．長雙鏈RNA被細胞內(nèi)的雙鏈RNA特異性核酸酶切成21－23個堿基對的短雙鏈RNA，稱為小干涉性RNA(siRNA)。

2．siRNA與細胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，該復(fù)合體可識別與siRNA有同源序列的mRNA，并在特異的位點將該mRNA切斷。

應(yīng)用：功能基因組學(xué)、微生物學(xué)、基因治療如病毒性疾病的治療、遺傳性疾病的治療、腫瘤病的治療。