編者按

近日，浙江大學(xué)藥學(xué)院、組分中藥國家重點實驗室浙江大學(xué)交叉創(chuàng)新中心范驍輝團(tuán)隊與天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院樊官偉團(tuán)隊，在Small Methods（IF: 14.188）期刊發(fā)表了題為“Single-cell RNA Sequencing Reveals the Temporal Diversity and Dynamics of Cardiac Immunity after Myocardial Infarction”的論文，揭示了各免疫細(xì)胞對心肌梗死后損傷修復(fù)過程的動態(tài)調(diào)控作用，相關(guān)研究結(jié)果從免疫炎癥調(diào)控環(huán)節(jié)深入詮釋了丹參酮IIA治療心肌梗死的具體機(jī)制，也為其臨床應(yīng)用提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。歐易生物提供了該項目單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序和分析相關(guān)工作，下面我們一起學(xué)習(xí)這篇文章的具體內(nèi)容。

材料：小鼠心臟中的Cd45細(xì)胞

期刊：

發(fā)表時間：2022年1月13日

方法：歐易生物10x Genomics scRNA-seq

研究背景

心肌梗死（MI）是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率的主要原因之一，其特點是免疫細(xì)胞的招募與激活。免疫細(xì)胞參與心肌梗死后最初的促炎過程以及后來的抗炎反應(yīng)，包括在傷口愈合或重塑中發(fā)揮作用。心臟免疫細(xì)胞是高度異質(zhì)性的，它們在心肌梗死發(fā)展過程中的激活是不同的。一些細(xì)胞類型，如巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，在心肌梗死的多種病理生理過程中起著核心作用，它們的起源和功能不同，由不同的亞群組成。然而，人們對心臟免疫的復(fù)雜多樣性知之甚少。因此，需要對心肌梗死后心臟免疫的時間動力學(xué)進(jìn)行系統(tǒng)分析，以開發(fā)特定時間的免疫調(diào)節(jié)干預(yù)措施。

?研究內(nèi)容?

本研究對心肌梗死模型以及丹參酮IIA給藥干預(yù)后第3、7和14天小鼠心臟中的Cd45細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞類型鑒定、數(shù)量變化研究、發(fā)育軌跡判斷和細(xì)胞間相互作用關(guān)系推測等分析。該研究主要集中在巨噬細(xì)胞上，巨噬細(xì)胞在心肌梗死后早期急劇擴(kuò)張，在促進(jìn)過度炎癥反應(yīng)或提供組織修復(fù)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用。M?-5和M?-6為主要的浸潤亞群，炎癥因子表達(dá)較強。同時該研究還確定了中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞群體的時間變化和作用，并且使用丹參酮IIA治療后scRNA-seq數(shù)據(jù)分析解釋了丹參酮IIA治療心肌梗死的具體機(jī)制，同時為臨床治療心肌梗死提供了依據(jù)。

?研究解析?

1. scRNA-seq檢測MI后不同時間心臟免疫細(xì)胞組成?

為了識別不同的心臟免疫細(xì)胞類型，并綜合表征其在心肌梗死病理進(jìn)程中的動態(tài)變化，作者對心肌梗死（MI）后不同時間點（0、3、7和14d）小鼠心臟中的Cd45細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析（Fig. 1a）。四個時間點反映著心肌梗死的主要階段，對應(yīng)著炎癥細(xì)胞浸潤以及心肌纖維化進(jìn)程的增加（Fig. 1b）。通過降維聚類將細(xì)胞分為7個細(xì)胞群（Fig. 1c），并將每個細(xì)胞群的Top5差異基因進(jìn)行熱圖展示（Fig. 1d）。第3天時巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最高，并且在第7天時T細(xì)胞、B細(xì)胞、中粒細(xì)胞顯著增加，14天時免疫組成與Sham組相似，表明成功控制住疾?。‵ig. 1e）。上述結(jié)果表明，不同免疫細(xì)胞在不同時間點浸潤，并通過不同的功能對心肌梗死作出反應(yīng)。

Figure 1. 對心肌梗死中4個樣本的心臟Cd45細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq，揭示心肌梗死后7個免疫細(xì)胞群的動態(tài)

2.?通過功能定義不同心臟巨噬細(xì)胞亞型

巨噬細(xì)胞是駐留在心臟或侵襲梗死心肌的最豐富的免疫細(xì)胞。由于單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞存在潛在的分化關(guān)系，作者將單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞進(jìn)一步降維聚類分為12個clusters（Fig. 2a，b）。對和的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其中M?-1、M?-2、M?-3和M?-4高表達(dá)，并且M?-4低表達(dá)但卻與M?-1有共同的炎癥基因（Fig. 2b，c）。在MI后第3天，M?-2和M?-3明顯增多，而M?-4在第3天后增加更加明顯（Fig. 2d），表明高表達(dá)細(xì)胞群在MI進(jìn)展的不同時間點展現(xiàn)出了不同的促炎功能。M?-5和M?-6都富集到了白細(xì)胞遷移和趨化相關(guān)特征，但是M?-5高表達(dá)并且在第3天明顯增加，另一方面M?-6低表達(dá)并且具有更加復(fù)雜的功能，在0-3天過程中擴(kuò)增了近4倍（Fig. 2b，c，d）。M?-7、M?-8、M?-9和M?-10低表達(dá)和為組織駐留巨噬細(xì)胞，其中不同細(xì)胞群展示了不同的功能以及變化趨勢。M?-11具有細(xì)胞周期和增殖標(biāo)志物高表達(dá)和限制表達(dá)的特點。另外，免疫熒光染色結(jié)果表明，MI后第3天出現(xiàn)了大量巨噬細(xì)胞（Fig. 2e）。

Figure 2. 心肌巨噬細(xì)胞在心肌梗死進(jìn)展中具有高度異質(zhì)性和獨特的功能

3.?心肌梗死后巨噬細(xì)胞亞群的動態(tài)變化

為探究MI后不同巨噬細(xì)胞亞群的動態(tài)變化，作者對巨噬亞群進(jìn)行擬時序分析（Fig. 3a）。分析結(jié)果表明，時間起始于單核細(xì)胞，隨后是高表達(dá)MHC細(xì)胞群，最后為駐留樣或梗死后細(xì)胞群。M?-5高表達(dá)并與單核細(xì)胞一起出現(xiàn)（Fig. 3b），因此可能是由單核細(xì)胞分化的典型梗死后炎癥細(xì)胞群。而M?-6出現(xiàn)在軌跡的最遠(yuǎn)處，并且有一部分與M?-8共享同一分支，表明M?-6起源于循環(huán)血細(xì)胞和自擴(kuò)增的駐留細(xì)胞群（Fig. 3b）。為探究單核細(xì)胞與高表達(dá)、細(xì)胞亞群的發(fā)育關(guān)系，作者通過擬時序分析發(fā)現(xiàn)，M?-2和M?-3由具有炎癥特征的M?-1發(fā)育而來，而非直接由單核細(xì)胞發(fā)育而來（Fig. 3c），并使用熱圖展示了擬時序過程中的基因變化及GO富集結(jié)果（Fig. 3d）。另外擬時序結(jié)果還表明，在第3天單核細(xì)胞與巨噬細(xì)胞發(fā)生復(fù)雜轉(zhuǎn)化，而第7天梗死亞群基本消失，M?-1和M?-4增加（Fig. 2d，3b）。

Figure 3. 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在真實心肌梗死進(jìn)展和擬時序中的時間動態(tài)

4.?心肌梗死進(jìn)程中巨噬細(xì)胞的時間特異性分子表達(dá)模式?

為了進(jìn)一步闡明心肌梗死環(huán)境下心肌巨噬細(xì)胞內(nèi)的時間分子變化，作者分析了不同時間點的差異基因表達(dá)，并對基因進(jìn)行GO富集分析。結(jié)果表明，MI后第3天上調(diào)基因富集為趨化因子或細(xì)胞因子活性，在早期白細(xì)胞浸潤中發(fā)揮關(guān)鍵作用（Fig. 4a，b，c）；巨噬細(xì)胞在第7天的主要特征是抗原呈遞和加工，促進(jìn)適應(yīng)性免疫反應(yīng)（Fig. 4a，b，c）；在第14天與細(xì)胞外基質(zhì)成分相關(guān)基因上調(diào)，參與細(xì)胞-細(xì)胞間和細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用（Fig. 4a，b，c）。上述結(jié)果闡明了心臟巨噬細(xì)胞的分子變化過程（Fig. 4d），作者通過免疫熒光染色進(jìn)行了驗證（Fig. 4e）。在心肌梗死進(jìn)程中，代表不同生物學(xué)功能的特征基因表現(xiàn)出時間特異性表達(dá)。

Figure 4. 心肌梗死進(jìn)展中巨噬細(xì)胞的時間特異性分子表達(dá)模式

5. 中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞亞群及其與巨噬細(xì)胞的動態(tài)相互作用

中性粒細(xì)胞是先天免疫系統(tǒng)中的主要細(xì)胞類型，可以調(diào)節(jié)心肌梗死后炎癥反應(yīng)，為探究中性粒細(xì)胞在MI進(jìn)程中的異質(zhì)性與可塑性，作者對改細(xì)胞群進(jìn)行了降維聚類分析（Fig. 5a）。對不同時間點細(xì)胞亞群占比進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)（Fig. 5b），N1細(xì)胞群特異性出現(xiàn)在第3天，并表達(dá)大量的趨化因子基因，引發(fā)心肌梗死部位其他免疫細(xì)胞大量外溢；N2細(xì)胞群作為另一個促炎亞群在心肌梗死后出現(xiàn)輕微擴(kuò)增，對中性粒介導(dǎo)的宿主防御具有重要作用；N3細(xì)胞群在第7天最豐富，表達(dá)與凋亡信號通路相關(guān)的基因。對中性粒細(xì)胞亞群進(jìn)行擬時序分析（Fig. 5c），發(fā)現(xiàn)隨著表達(dá)量的升高，表達(dá)量逐漸降低（Fig. 5d），N3出現(xiàn)在軌跡末端，表現(xiàn)出最高的老化和凋亡評分（Fig. 5e）。為探究中性粒細(xì)胞與巨噬細(xì)胞間的交流，作者使用CellPhoneDB進(jìn)行了細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)分析（Fig. 5F），結(jié)果表明巨噬細(xì)胞通過與細(xì)胞粘附和趨化相關(guān)的配體受體對，與N1和N2的相互作用增加，而N3的遷移能力降低，表明在心肌梗死后第7天出現(xiàn)的最豐富的N3亞群推動從炎癥期向修復(fù)期的轉(zhuǎn)變，因為死亡的中性粒細(xì)胞有可能限制心肌梗死后的炎癥反應(yīng)。

T細(xì)胞與B細(xì)胞是心肌淋巴細(xì)胞的主要成分，作者對其進(jìn)行了亞群分析（Fig. 5g，h）。T細(xì)胞分為7個亞群，其中CD8T在MI后第3天占主導(dǎo)地位；B細(xì)胞分為4個亞群，其中B2在所有時間點均存在，B細(xì)胞Ccl7介導(dǎo)單核細(xì)胞的招募，并且Ccr7可能增強B細(xì)胞抗原表達(dá)和遷移到T細(xì)胞區(qū)（Fig. 5i）。

Figure 5. 中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的時間多樣性和動態(tài)

6. 抑制早期浸潤的M?-5和M?-6可減輕病理性MI進(jìn)展

MI后第三天為急性炎癥期，可能對疾病的調(diào)節(jié)至關(guān)重要，同時這個時期巨噬細(xì)胞明顯擴(kuò)增。為尋找對MI進(jìn)行干預(yù)的關(guān)鍵細(xì)胞群，作者進(jìn)行以下分析。對不同巨噬亞群對疾病貢獻(xiàn)得分進(jìn)行分析展示，發(fā)現(xiàn)M?-5和M?-6在所有巨噬細(xì)胞亞群中貢獻(xiàn)得分最高，說明它們在加重疾病進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用（Fig. 6a）。為進(jìn)一步探究靶向M?-5和M?-6是否可以減輕缺血損傷，作者使用一種從傳統(tǒng)藥用植物丹參中分離出的天然心肌保護(hù)劑丹參酮IIA進(jìn)行實驗。使用心肌梗死模型以及丹參酮IIA給藥干預(yù)后第3、7和14天小鼠心臟中的Cd45細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測序（Fig. 6b），并將兩組數(shù)據(jù)整合分析。結(jié)果表明，在第3天丹參酮IIA處理組，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞明顯降低（Fig. 6c），M?-5和M?-6作為兩個優(yōu)勢亞群，丹參酮IIA處理后細(xì)胞比例顯著下降60%（Fig. 6d），該結(jié)論通過免疫熒光染色實驗進(jìn)行了證實（Fig. 6e），表明M?-5和M?-6可能是丹參酮IIA干預(yù)的靶點。丹參酮IIA處理后M?-5和M?-6趨化因子表達(dá)明顯降低，且M?-5炎癥相關(guān)組織蛋白酶降低，M?-6中解決炎癥相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)降低，表明M?-5和M?-6的細(xì)胞比例和功能基因都有可能成為干預(yù)MI的靶點（Fig. 6f）。上述結(jié)果表明，抑制早期浸潤的巨噬細(xì)胞亞群（M?-5和M?-6）在減緩病狀MI進(jìn)展中的有效性，表明細(xì)胞類型和時間特異性干預(yù)的重要性。

Figure 6.?丹參酮IIA治療證實了早期浸潤巨噬細(xì)胞亞群抑制在減輕病源性心肌梗死進(jìn)展中的有效性

?研究結(jié)論?

1. 巨噬細(xì)胞在心肌梗死后早期急劇擴(kuò)張，在促進(jìn)過度炎癥反應(yīng)或提供組織修復(fù)方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用；

2. 丹參酮IIA的治療表明，細(xì)胞類型和時間特異性的干預(yù)對心肌梗死具有有效的臨床應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

Jin K, Gao S, Yang P, Guo R, Li D, Zhang Y, Lu X, Fan G, Fan X. Single-Cell RNA Sequencing Reveals the Temporal Diversity and Dynamics of Cardiac Immunity after Myocardial Infarction. Small Methods. 2022 Jan 13:e2100752. doi: 10.1002/smtd.202100752. Epub ahead of print. PMID: 35023642.?

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