microRNA-378a-3p 生物合成的激活通過(guò)調(diào)節(jié) ApoB100-Sotilin1 軸促進(jìn) VLDL 的肝臟分泌和高脂血癥

背景

高脂血癥是動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病 (CVD) 的主要危險(xiǎn)因素。作為高脂血癥的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，他汀類藥物只能將冠狀動(dòng)脈疾病的風(fēng)險(xiǎn)降低 20-40%，這凸顯了確定分子途徑對(duì)于設(shè)計(jì)抗這種疾病藥物的重要性。據(jù)報(bào)道，高脂血癥和 CVD 患者的 microRNA表達(dá)發(fā)生變化。本研究旨在確定高脂血癥狀態(tài)下miR-378a-3p失調(diào)的機(jī)制，并評(píng)估m(xù)iR-378a-3p如何調(diào)節(jié)肝臟VLDL分泌。

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實(shí)驗(yàn)流程

1、研究發(fā)現(xiàn)miR-378a-3p可能參與調(diào)節(jié)脂蛋白代謝，通過(guò)生信分析及軟件預(yù)測(cè)miR-378a-3p的靶基因，結(jié)果顯示?miR-378a-3p 在Sort1的 3'UTR 內(nèi)有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。將?miR-378a-3p模擬物與Sort1共轉(zhuǎn)進(jìn)細(xì)胞，通過(guò)?qRT-PCR 、熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)、WB驗(yàn)證Sort1在體外和體內(nèi)都是 miR-378a-3p 的直接靶標(biāo)。

2、miR-378a-3p 的肝臟特異性表達(dá)增加了循環(huán) VLDL/LDL 膽固醇和 TG 的水平

接下來(lái)，作者檢查了miR-378a-3p 的功能獲得。首先選取持續(xù)八周的高脂肪飲食（HFD）喂養(yǎng)下的兩組C57BL/6野生型小鼠，每周將1.5 μg/g肝臟特異性表達(dá)?MC -?TTR?-miR-378a 或?qū)φ蛰d體 (MC -?TTR?-miR-378a-MM)與in vivo -jetPEI（Polyplus Transfection）分別分別加入 5% 葡萄糖溶液中，并混合在一起。在室溫下孵育 15 分鐘后，將復(fù)合物通過(guò)尾靜脈注射到小鼠體內(nèi)，持續(xù)八周。此時(shí)，麻醉小鼠，通過(guò)心臟穿刺采血。隨后，收獲肝臟并立即在液氮中冷凍以進(jìn)行基因表達(dá)和組織學(xué)分析。

通過(guò)qPCR、檢測(cè)總血漿甘油三酯和膽固醇的水平、FPLC以及血漿中ApoB100和ApoB48的水平的方法確定了?miR-378a-3p 促進(jìn) VLDL 的肝臟分泌，從而增加血漿 TG 和 LDL/VLDL 膽固醇的水平。

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3、作者進(jìn)一步確定了 miR-378a-3p 的功能喪失。由于miRNA 可以同時(shí)靶向許多基因。所以，作者還確定了Sort1在介導(dǎo) miR-378a-3p 促進(jìn) VLDL 肝臟分泌中的作用。HFD 8 周后，野生型小鼠被隨機(jī)分為三組，并接受八周不同的處理。第一組注射陰性對(duì)照（ASO-MM）；第二組注射miR-378a-3p-ASO來(lái)誘導(dǎo)Sort1表達(dá)；第三組注射miR-378a-3p-ASO 和Sort1?shRNA 的組合。通過(guò)qPCR，檢測(cè)總血漿中TG及膽固醇水平、FPLC以及血漿中ApoB100和ApoB48的水平表明 miR-378a-3p 促進(jìn) VLDL 的肝臟分泌，從而增加血漿 TG 和 LDL/VLDL 膽固醇的水平。

4、接下來(lái)，作者為了確定?miR-378a-3p 對(duì) ApoB100 降解和分泌的影響以及SORT1是否介導(dǎo) miR-378a-3p對(duì)ApoB100 的降解和分泌的影響。作者建立了穩(wěn)定表達(dá) miR-378a-3p (HepG2-miR)的 HepG2 細(xì)胞系，通過(guò)qRT檢測(cè)sort1以及ApoB100的表達(dá)以及代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明了需要 SORT1 來(lái)增加 ApoB100 的穩(wěn)定性和分泌。

5、由于體外研究證實(shí) miR-378a-3p 可增強(qiáng) ApoB100 的穩(wěn)定性和分泌。接下來(lái)作者假設(shè) miR-378a-3p 應(yīng)該增加體內(nèi) VLDL 的產(chǎn)生和分泌。為了驗(yàn)證假設(shè)，八周大的 C57BL/6 小鼠被注射了 MC -?TTR?-miR-378a 或 MC -?TTR?-miR-378a-MM（對(duì)照）以實(shí)現(xiàn)Sort1敲低。注射后 8 周，小鼠禁食 4 小時(shí)，通過(guò) Triton WR1339 處理、代謝標(biāo)記實(shí)驗(yàn)、QPCR等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果表明miR-378a-3p 能夠增加 VLDL 的產(chǎn)生和分泌。

讀到這里，對(duì)于體內(nèi)轉(zhuǎn)染的應(yīng)用是不是又有了更近一步的了解呢！除了之前可以作用于腫瘤，本期還介紹了肝臟方面的應(yīng)用，當(dāng)然除了這些，還有其他方面的應(yīng)用。詳情請(qǐng)點(diǎn)擊下方數(shù)據(jù)庫(kù)鏈接

https://www.polyplus-transfection.com/resources/cell-transfection-database/?type=invivo&reagent%5B%5D=500&fsearch=&subbtn=Search

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參考文獻(xiàn)

Zhang T , ?Shi H , ?Liu N , et al. Activation of microRNA-378a-3p biogenesis promotes hepatic secretion of VLDL and hyperlipidemia by modulating ApoB100-Sortilin1 axis[J]. Theranostics, 2020, 10(9):3952-3966.

往期參考

活體轉(zhuǎn)染第一彈

https://mp.weixin.qq.com/s/efHr6kVYcyN2M9Uy-MZaJg

活體轉(zhuǎn)染第二彈

https://mp.weixin.qq.com/s/s_XoR91po12G7f-Ri3Rz2g

活體轉(zhuǎn)染第三彈

https://mp.weixin.qq.com/s/n1WA91sxphfsu1xMQAHoEQ

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