基因的表達調(diào)控是研究基因功能和相關(guān)分子機制中最為常用的方法，也是生物醫(yī)學科研領(lǐng)域最基本的內(nèi)容。隨著研究的深入，人們對于目的基因的表達調(diào)控也有不同的需求，例如需要調(diào)控目的基因在特定時間表達或下調(diào)，以觀察在某一狀態(tài)或某一時間段內(nèi)基因表達變化對細胞或機體生長狀態(tài)或表型的影響。Gossen及其同事在1992年和1995年的兩項開創(chuàng)性工作中為控制基因表達帶來了福音，他們成功引入了基因開關(guān)來控制真核生物中的基因表達[1, 2]。即目前廣泛應用于基礎研究和基因治療的tet-on和tet-off基因表達系統(tǒng)，下面就來具體了解下這兩種基因表達系統(tǒng)吧。

?????? Tet其實是四環(huán)素的英文Tetracycline簡寫過來的，因此tet-on和tet-off是指由四環(huán)素控制的基因表達系統(tǒng)?！皁n”有“開”的意思，tet-on系統(tǒng)是在使用四環(huán)素或其衍生物后即可激活基因的表達；相反，“off”是“關(guān)”，tet-off系統(tǒng)則是通過使用四環(huán)素來沉默基因表達。

?????? 這種Tet控制的基因表達系統(tǒng)源自于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10 tet抗性操縱子。Tet對于革蘭氏陰性菌是一種強效抗生素，為抵御Tet的殺傷作用，細菌通過進化表達一種定位于細胞膜上的TetA抗性蛋白來實現(xiàn)對Tet的抗性。其妙處在于TetA是由Tet條件性誘導表達的。通常情況下（沒有Tet的情況下），TetA不會表達，因四環(huán)素阻遏物（TetR）二聚體在TetA啟動子區(qū)與操縱子序列TetO結(jié)合，從物理上阻礙了TetA啟動子的轉(zhuǎn)錄起始，進而抑制其的表達。當細胞內(nèi)Tet濃度升高時，Tet與TetR結(jié)合形成復合物，TetR構(gòu)象發(fā)生變化而無法結(jié)合TetO，使TetA得以起始轉(zhuǎn)錄表達，而胞內(nèi)Tet濃度下降時，TetA表達隨之逐漸被抑制。這種TetR與TetO的結(jié)合使得基因可通過條件性誘導其表達，并且調(diào)控是可逆的，為轉(zhuǎn)化應用到真核生物中條件性調(diào)控基因表達提供了基礎。

? 由此可見，tet調(diào)控系統(tǒng)應用到的主要元件是TetR與TetO。

Tet系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與原理[3]

?????? Tet-off系統(tǒng)：1992年由Gossen等人針對TetR與TetO元件率先開發(fā)的、應用于哺乳動物的基因表達調(diào)控系統(tǒng)。Tet-off系統(tǒng)包含兩個部分結(jié)構(gòu)，第一部分是將TetR與單純皰疹病毒VP16的轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域融合，得到可由Tet控制的轉(zhuǎn)錄激活因子（tTA）；第二部分是Tet反應啟動子（Ptet），這是將TetO序列融合到缺乏增強子序列的最小啟動子CMV前面。當沒有給與Tet的情況下，tTA與Ptet結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的作用下激活下游基因的表達；當施加Tet或其衍生物后，tTA與Tet結(jié)合而構(gòu)象改變，無法與Ptet結(jié)合，使得缺乏增強子的CMV啟動子不足以支持轉(zhuǎn)錄起始，進而“關(guān)閉”基因表達。

?????? Tet-on系統(tǒng)：如果只需要在某一時間段表達目的基因，那么對于tet-off系統(tǒng)在該時間段以外就需要持續(xù)使用誘導劑處理，顯然是不方便的。于是Gossen帶領(lǐng)團隊在1995年開發(fā)了tet-on系統(tǒng)來解決這一問題，該系統(tǒng)與tet-off相反，它需要添加誘導劑來激活基因表達。實現(xiàn)tet-on系統(tǒng)與tet-off系統(tǒng)的不同點在于對TetR做了突變，產(chǎn)生出一個作用相反的TetR，因此與VP16融合后稱為rtTA。第二個結(jié)構(gòu)Ptet啟動子不變。tet-on系統(tǒng)在沒有Tet相關(guān)誘導劑的時候，rtTA基本不與Ptet結(jié)合，下游基因表達受抑制；在給與誘導劑后，rtTA與Tet結(jié)合使其與Ptet結(jié)合，進而激活下游基因表達。但tet-on系統(tǒng)存在較高的表達泄露風險，后來開發(fā)了M2rtTA2代替rtTA，可以降低表達泄露的風險，之后再進一步對M2rtTA2設計5個氨基酸突變，表達的蛋白命名為Tet-on 3G蛋白（TRE3G），可優(yōu)化與四環(huán)素相應元件的結(jié)合，以進一步提高對誘導劑的敏感性和降低表達泄露風險。

?????? 誘導劑則是Tet及其衍生物，Tet和一些衍生物（如多西環(huán)素，Dox）已經(jīng)廣泛用于人類和動物的臨床應用中，并且都有詳細的藥理學和藥代動力學的研究，證明使用是安全的。因此，Tet基因表達調(diào)控系統(tǒng)不僅可用于基礎研究，也可應用于臨床基因治療當中。但實際應用當中，Tet對tTA和rtTA的親和力遠不如Dox，Dox僅需較低濃度即可激活tet-on和tet-off系統(tǒng)。

?????? 總言之，Tet系統(tǒng)是目前使用最廣泛的藥物誘導轉(zhuǎn)基因表達系統(tǒng)之一，能夠滿足科研工作者在時間上控制基因表達的需求，可模擬細胞或機體生長發(fā)育不同階段目的基因的表達變化，進而研究其中的功能和規(guī)律。漢恒生物可提供基于慢病毒載體和腺病毒載體的tet-on表達系統(tǒng)，歡迎聯(lián)系了解咨詢~

參考文獻

[1]. Gossen, M. and H. Bujard. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992, 89(12): 5547-51.

[2]. Gossen, M., S. Freundlieb, G. Bender, et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science, 1995, 268(5218): 1766-9.

[3]. Das, A.T., L. Tenenbaum, and B. Berkhout. Tet-On Systems For Doxycycline-inducible Gene Expression. Curr Gene Ther, 2016, 16(3): 156-67.