瀏覽到今年在NC上發(fā)表的一篇針對孤雌生殖的六倍體普魯士鯉魚的基因組文章，作者組裝到了單體型水平，前段時間也看到了國內(nèi)學(xué)者對孤雌的銀鯽的文章，發(fā)在了NG上，這兩篇文章都需要好好學(xué)習(xí)一下，先看一下NC這篇，時間原因，整理了下大致意思，方便自己以后回憶文章內(nèi)容，翻譯不通的地方以后再完善了。

一．背景：

普魯士鯉魚(Prussian carp)，又叫銀鯽，原產(chǎn)于亞洲，在歐洲是入侵物種。它是金魚的近親，并與瀕危的本地鯽魚爭奪同一棲息地。然而，金魚和本地鯽魚通常都是有性繁殖，而普魯士鯉魚有一個主要的進(jìn)化優(yōu)勢:孤雌生殖。但是，雌性普魯士鯉魚卻占用了雄性鯽魚或其他鯉魚的精子，然后再丟棄它們。被劫持的精子刺激普魯士鯉魚的卵細(xì)胞分裂。然后雄性的遺傳物質(zhì)在卵細(xì)胞中被分解而不被利用。這被稱為依賴精子的孤雌生殖，或處女生殖。所有通過這種方式產(chǎn)生的后代都是普魯士鯉魚雌性的克隆體。因此，大多數(shù)普魯士鯉魚種群都是雌性，雄性很少出現(xiàn)。

普魯士鯉魚是六倍體，有六組染色體。其中四種是通過與不相關(guān)的魚類雜交而得到的，另外兩種是通過與一種近親魚類雜交而得到的。多倍體物種研究中通常會關(guān)注的有一些主要問題，比如基因數(shù)目增加的分子變化、性別決定機(jī)制、減數(shù)分裂和生理的影響以及與二倍體同體的相互作用。尤其是三倍體減數(shù)分裂過程，通常需要其它無性繁殖方式產(chǎn)生后代。

為了更好的理解其單性繁殖背后的機(jī)制，奧地利蒙德塞因斯布魯克大學(xué)湖沼學(xué)研究部的Dunja Lamatsch對普魯士鯉魚的基因組進(jìn)行了測序組裝。

二．結(jié)果：

Genome sequencing, chromosome assembly and annotation

通過PacBio平臺對一六倍體銀鯽進(jìn)行測序，數(shù)據(jù)量約為每一單倍型的~45-fold coverage，平均長度為19kb(sup Data1a)。對同一個體進(jìn)行Hi-C測序，每一個但北田鄉(xiāng)~97-fold coverage , reads 對數(shù)為1,639,548,159。通過hifiasm組裝PacBiao的HiFireads到haplotigs，然后將Hi-C數(shù)據(jù)比對到haplotigs上輔助組裝到scaffold水平，scaffold的N50達(dá)到了30.7MB，Contig的N50達(dá)到了4.3Mb。通過手動調(diào)整或得了普魯士鯉魚六倍體的染色體所對應(yīng)的150條長scaffolds序列。總體上，93%的，5.07Gb組裝序列能夠標(biāo)記到染色體上。

蛋白編碼基因組注釋，采用了同源物種預(yù)測、RNA-seq和從頭預(yù)測策略，注釋到152,308個蛋白編碼基因(Sup Data2)。150,182(98.6%)能夠blast到Swissprot/Refseq數(shù)據(jù)庫，130,496(85.7%)比對到Pfam數(shù)據(jù)庫。In total, 9015(5.9%) 個基因?yàn)閱瓮怙@子基因。此外或得了16,571個tRNA,348 rRNA, 1495 miRNA,和9258個其它的ncRNA(Sup Data3a)。18,131(12%)個假基因被預(yù)測到。經(jīng)過注釋后，基于Actinopterygii_odb9，BUSCO評估完整性從94.7提到到99.2%。

普魯士鯉魚基因組含有41.3%的重復(fù)序列(Sup Data3b), 基因組中分布35.1%的大量的重復(fù)元件，其中5.9%為未知。豐度最高的轉(zhuǎn)座元件為Helitrons(3.19%),L2(2.85%)和hAT-Ac(2.54%)元件。

Haplotype-resolved structure of the hexaploid genome

為了理解基因組遺傳特征和多倍化過程，和兩種進(jìn)行雙性生殖的四倍體金魚、四倍體鯉魚，三種二倍體鯉魚進(jìn)行全基因組的基因組比較分析，確定了25組共線性、同源染色體區(qū)段。

系統(tǒng)發(fā)育樹計(jì)算每組共線性區(qū)段(Fig2a)發(fā)現(xiàn)普魯士鯉魚的基因組結(jié)構(gòu)由三組單倍型(a-c,Fig.2b)組成, 每一組由兩種haplotype組成，這兩種來自異源四倍體的鯉魚和金魚鯉類基因組染色體，命名為A和B(即AaAbBaBb)。這總共產(chǎn)生了兩個類似于A和B的三倍體，即6個單倍型(AaAbAcBaBbBc)，每個單倍型有25條染色體。在染色體構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，6個單倍型中的Ac、Bc和其它兩個單倍型分離，并與C. Auratus關(guān)系更密切(圖2)。

a. 采用ML方法，對C.gibelio六倍體基因組中6*25的haplotype中每一個都在全基因組范圍內(nèi)(coding和non-coding 序列)的構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其haplotypes (CarGib_Aa, _Ab,_Ac, _Ba, _Bb, _Bc) 與祖先二倍體鯉類草魚(CteIde)、二倍體鯉類Onychostoma macrolepis (OnyMac)、異體四倍體普通鯉魚，Cyprinus carpio (CypCarA/B)、Carassius auratus (CarAur A/B)和二倍體斑馬魚(DanRer)的染色體序列進(jìn)行比較。亞基因組A和B分支長度有一些輕微的差異。Aa和 Ab和CypCar_A和CarAur_A聚類到一起， Ba 和 Bb 和 CypCar_B 和CarAur_B聚類到一起。

b. 六倍體 Prussian carp (C. gibelio) 基因組亞基因組結(jié)構(gòu)分析。

普魯士鯉魚有兩個亞基因組A和B,每個亞基因組分為三個單倍型a，b，c。AaAb和BaBb代表兩個二倍體祖先物種染色體組成，通過雜交產(chǎn)生了四倍體Carassius 和 Cyprinus 譜系的共同祖先(AaAbBaBb)，普魯士鯉染色體加倍多了兩個染色體組(AcBc)，因此包含150 (= 6 × 25)條染色體。藍(lán)色或者綠色(a，b)和紅色(c) 線條分別代表同源等位基因和部分同源等位基因。

為了闡明同源多倍體或異源多倍體的三個亞基因組(即單倍型a、b、c)的起源，研究人員采用了一種策略，該策略已成功地用于異源多倍體非洲爪蟾(Xenopus laevis)基因組和同源多倍體小體鱘基因組。其推理基礎(chǔ)為:異源多倍體中，基因組中快速進(jìn)化的移動元件的重復(fù)和遺跡為異源多倍體祖先所有，因此會聚集在系統(tǒng)發(fā)生樹的單獨(dú)分支中。對于同源倍體染色體組，重復(fù)元件不能區(qū)分同源體。在金魚基因組中，基于20種類型的TEs，確認(rèn)鯉魚特異性全基因組復(fù)制(Cs4R)為異源多倍體，而這些TEs,幾乎只富集在一個亞基因組中。使用這20種TEs和通過SBI分析確定的其它5種TEs，在普魯士鯉基因組中發(fā)現(xiàn)，富集到亞基因組A或者B中的TEs和鯉系四倍體祖先 (Cs4R)一致(Fig. 3 and SupFig. 2)。然而，a、b和c三個單倍型在TE密度上沒有顯著差異，表明其同源多倍體起源。

Fig3.六倍體普魯士鯉染色體上轉(zhuǎn)座元件DNA-X-8_DR、hAT-N91_DR、TC1DR2和Mariner-12_DR的密度，呈A、B亞基因組偏置分布。TEs密度以染色體長度歸一化(Mbp)的頻數(shù) (num)計(jì)算。

采用Subgenome-biased index，SBI，方法揭示普魯士鯉是異源多倍體還是同源多倍體。TE的SBI值從0到1，當(dāng)值接近1時，說明TE在a、b、c中的一條染色體上差異富集。這種TEs可用于從同源染色體中區(qū)分等位基因，并用于區(qū)分六倍體普魯士鯉的最近發(fā)生的異源或同源染色體加倍事件。然而，從這個分析中沒有明顯的這種TEs (Fig4b和SupFig3),因此沒有證據(jù)支持單倍型a、b和c是異源多倍體。

Phylogenomics and divergence time estimates

為了確定普魯士鯉在鯉亞科種中的遺傳位置并估計(jì)其分化時間，篩選所有物種和普魯士鯉亞基因組A和B上的直系同源基因集，并計(jì)算基因組的同義替換率(Ks)，SupData6。普魯士鯉和金魚親源性最近，這兩種譜系在100萬~200萬年前分化，異體四倍體Carassius譜系祖先的A和B基因組的祖先分化時間要長得多，大約在15-28 Mya年前，四倍化事件估計(jì)在8.3至18 Mya年之間(Fig. 5)。

Subgenome dominance and rediploidization

六倍體異育銀鯽的基因組進(jìn)化包括兩個不同的階段:一是來自異源四倍體鯉族祖先的古代亞基因組A和B的進(jìn)化，二和AcBc 的同源染色體加倍。

在這個異源多倍體譜系(這里是A和B亞基因組)去多倍體化的過程中，一些基因副本可能會隨機(jī)丟失，可能發(fā)生在兩個亞基因組上，也可能優(yōu)先發(fā)生在一個亞基因組上。普魯士鯉B亞基因組上蛋白質(zhì)編碼基因的總數(shù)(BaBbBc = 77204)略高于A亞基因組(AaAbAc = 75104)( SupData2)。這種基因含量的差異可以用B組3號和22號染色體長度更長來解釋(SupFig5)。

根據(jù)進(jìn)化分支長度，進(jìn)化更快的A亞基因組BUSCO基因缺失率為12.8-13.4%，而B亞基因組缺失率僅為7.8-8.2%。然后研究人員對亞基因組A和B上在BUSCO中missing的基因集進(jìn)行數(shù)目和功能富集分析，發(fā)現(xiàn)A基因組中缺失的基因會在B基因組中保留，反之亦然。Missing基因假定在普魯士鯉自多倍體化后缺失，24個基因中，3個基因(kansl3, mapk15, ighmbp2)在GO term中和“染色體組織”有關(guān)，一個基因(sra1)和有絲分裂細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)有關(guān)。推測到缺失的基因數(shù)量如此之少，可能是由于普魯士鯉魚出現(xiàn)的時間很短的原因。研究人員的結(jié)果與近期發(fā)生多倍化的植物選擇作用于DNA修復(fù)/管理/減數(shù)分裂基因的結(jié)果一致。

microRNAs和其它ncRNAs頻數(shù)在6個單倍型所有的染色體上沒有顯示出在哪個染色體上存在偏倚(Supplementary Fig. 6)，而tRNA和rRNA基因在一些染色體上數(shù)量存在明顯偏倚。

在異源多倍體基因組中，亞基因組的優(yōu)勢相對于復(fù)制丟失而言，會發(fā)生來自親本亞基因組之一的基因的過表達(dá)，因此，研究人員將RNA-seq reads比對到每個單倍體基因組上，比較了亞基因組上的轉(zhuǎn)錄活性 (Fig. 6)。B亞基因組的基因表達(dá)有增加的趨勢(它也丟失了較少的BUSCO基因)，但A亞基因組的4號和22號染色體基因在性腺中表達(dá)較高。在少數(shù)情況下，單倍型a、b或c中的一條染色體有表達(dá)偏倚，例如，眼睛中的24Bb染色體或肝臟中的22Ba和22Bc染色體。

左到右依次為亞基因組和單倍型AaAbAcBaBbBc

三．材料方法

Expression analyses

使用HISAT將來自腦組織、眼、性腺、肝和肌肉RNA-seq reads 比對到基因組

使用SAMTool統(tǒng)計(jì)比對到各個染色體上reads，比對到基因上使用featureCounts統(tǒng)計(jì)，每基因每百萬轉(zhuǎn)錄組本通過StringTie計(jì)算。條形圖和熱圖使用R的geom_bar in library ggplot包和heatmap.2 in gplots包。

Haplotype resolved hexaploid genome assembly

使用Hifiasm組裝 Pacbio HiFi reads，然后將HiFi reads通過Minimap2重新比對到“p_utg”和“p_ctg”上檢測uniform coverage，通過Bedtools genomecov (v2.25.0)計(jì)算每個堿基的coverage?！皃_ctg”多峰分布說明一些組裝區(qū)域?yàn)樗s區(qū)?！皃_utg”上coverage分布最均勻且只有一個峰值，可認(rèn)為是完全解析的單倍型。Omni-C reads通過juicer比對到haplotigs，然后通過自己的腳本和3d-DNA、Juicebox等軟件進(jìn)行輔助組裝。

Phylogenetic trees of whole chromosomes and identity assignment

六倍體Carassius gibelio基因組通過minimap2與鯉科基因組: diploid Onychostoma macrolepis (GCA_012432095.167), diploid Ctenopharyngodon idella (GCA_019924925.1), allotetraploid Cyprinus carpio (GCF_018340385.130), and allotetraploid Carassius auratus (GCA_014332655.112)比對。染色體共線性及配對比對通過Last aligner (v941)，1-to-1 matches通過 Lastsplit過濾。

總結(jié)：

該文章基因組單體型基因組組裝前半部分、亞基因組分析部分需要我去學(xué)習(xí)，尤其是Subgenome bias index的概念。

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