小伙伴們大家好，在實(shí)驗(yàn)中需要驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用時(shí)，你首先想到的是哪個(gè)實(shí)驗(yàn)方法呢？

腦海中有沒有想到酵母雙雜交這個(gè)經(jīng)典的方法呢？其實(shí)很多小伙伴都知道這個(gè)實(shí)驗(yàn)，但是好像不太清楚實(shí)驗(yàn)的具體原理和操作（小編上學(xué)那會(huì)也是迷迷糊糊，似懂非懂的）。今天小編就和大家掰開揉碎講講酵母雙雜交。

首先來講一下原理：基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。反式轉(zhuǎn)錄激活因子的結(jié)構(gòu)往往由兩個(gè)或兩個(gè)以上可以分開的，功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域（domain）構(gòu)成。以GAL4為例，它包含DNA結(jié)合功能域（DNA binding domain，DNA-BD）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，DNA-AD）。這兩個(gè)結(jié)合域分開時(shí)仍分別具有功能，但不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)被分開的兩者通過適當(dāng)?shù)耐緩皆诳臻g上較為接近時(shí)，才能重新呈現(xiàn)完整的GAL4轉(zhuǎn)錄因子活性，使下游基因得到轉(zhuǎn)錄。

了解了原理我們?cè)賮砜纯丛趺?strong>將理論轉(zhuǎn)化為實(shí)踐吧。

首先將稱為bait（誘餌）的蛋白（即已知蛋白）構(gòu)建在BD載體中，并表達(dá)BD-bait融合蛋白；將prey（獵物）蛋白（即待測(cè)蛋白）構(gòu)建在AD載體上，表達(dá)AD-prey融合蛋白。如果bait和prey之間沒有相互作用，那么BD和AD就不能結(jié)合，下游的報(bào)告基因也就不能被激活。這里的報(bào)告基因可以是營(yíng)養(yǎng)缺陷等基因(最后可以通過觀察酵母是否生長(zhǎng)來看是否存在互作)。

接下來舉個(gè)簡(jiǎn)單的例子，以一篇文章來實(shí)際解讀一下酵母雙雜吧。

這篇文章做酵母雙雜是為了篩選可能與暹羅炭疽菌CAP20蛋白相互作用的候選蛋白。

1 構(gòu)建誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Cap20并檢測(cè)其自激活（Tip：pGBKT7是一種酵母表達(dá)載體，特別設(shè)計(jì)用于表達(dá)GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（BD）與bait蛋白的融合蛋白。融合蛋白在ADH1啟動(dòng)子下高水平表達(dá)。為了促進(jìn)體外轉(zhuǎn)錄，在pGBKT7的GAL4 DNA-BD的表位簽之間引入T7啟動(dòng)子。攜帶pGBKT7的酵母轉(zhuǎn)化效率較高）。

具體方法是將Cap20的522 bp片段克隆到質(zhì)粒pGBKT7的BamHI和PstI位點(diǎn)之間，產(chǎn)生pGBKT7-Cap20，通過酶消化確認(rèn)并產(chǎn)生大約7.3 kb和0.5 kb的條帶，這兩條帶就是質(zhì)粒的長(zhǎng)度和克隆片段的長(zhǎng)度。

將正確的重組質(zhì)粒pGBKT7-Cap20轉(zhuǎn)化到酵母雙雜交系統(tǒng)中。選擇SD/-Trp平板上直徑為2 mm的酵母菌落，并使用引物J-Cap20-F和J-Cap20-R進(jìn)行菌落PCR。在1%瓊脂糖凝膠珠上成功檢測(cè)到0.5kb條帶(即上面的522bp)，表明成功構(gòu)建了含有誘餌蛋白CAP20的酵母。用重組質(zhì)粒pGBKT7-Cap20（此質(zhì)粒編碼BD+Cap20）和pGADT7（此質(zhì)粒編碼GAL4 AD,沒有加獵物蛋白）成功轉(zhuǎn)化的酵母只能在SD/-Trp/-Leu平板上生長(zhǎng)（此平板是SD+兩種缺陷氨基酸混合物，攜帶色氨酸和亮氨酸的酵母可以在平板上生長(zhǎng)，而沒有的話則不能生長(zhǎng)），而不能在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade平板上生長(zhǎng)（同上）。該結(jié)果表明，在沒有獵物蛋白的情況下，含有pGBKT7-Cap20的質(zhì)粒不能自主激活酵母中報(bào)告基因的表達(dá)。

2?使用酵母交配篩選蛋白質(zhì)CAP20的相互作用成分。培養(yǎng)誘餌菌株pGBKT7-Cap20。將交配的培養(yǎng)物在SD/-Trp/-Leu培養(yǎng)基上孵育用于初步篩選。

然后將菌落移至選擇性SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal培養(yǎng)基，共獲得102個(gè)藍(lán)色酵母單菌落(X-α-Gal存在時(shí)，陽(yáng)性克隆會(huì)變成藍(lán)色)。篩選文庫(kù)后，從所有陽(yáng)性菌落中提取獵物質(zhì)粒，并用pGBKT7-Cap20將其重新轉(zhuǎn)化到Y187酵母中，并重新分析相互作用特征。獲得24個(gè)陽(yáng)性結(jié)果，從獵物中提取的相應(yīng)質(zhì)粒通過NCBI/BLASTx進(jìn)行測(cè)序和分析。

最終從102個(gè)陽(yáng)性克隆中獲得了16個(gè)不同的基因（圖1）。在相應(yīng)的蛋白質(zhì)中，發(fā)現(xiàn)了cAMP依賴性蛋白激酶催化亞基（PKAC1）、蛋白激酶、乙酸激酶、組氨酸酸性磷酸酶、鐵還原酶樣跨膜成分、疏水蛋白、糖蛋白、過敏反應(yīng)誘導(dǎo)蛋白和一些假設(shè)蛋白。

這張圖就是本篇文章的主要結(jié)果。其中：pGBKT7:P53 + pGADT7:Rec-T為陽(yáng)性對(duì)照；PGBKT7 + PGADT7為陰性對(duì)照（從這個(gè)圖我們就可以明顯看出來，陽(yáng)性對(duì)照和那16中陽(yáng)性的獵物的培養(yǎng)皿中酵母生長(zhǎng)良好，證明其存在相互作用，激活了下游的報(bào)告基因，而陰性對(duì)照和pGBKT+Cap20+ pGADT7則沒有激活報(bào)告基因。）Tip：pGBKT7:P53編碼一種GAL4 DNA-BD和鼠源的p53融合蛋白，而pGADT7:Rec-T編碼GAL4 AD的融合蛋白。

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