一、EDTA-胰蛋白酶的配制實(shí)驗(yàn)簡介：

EDTA-胰蛋白酶的配制實(shí)驗(yàn)所需的EDTA是乙二胺四乙酸，一種金屬螯合劑。它通常與胰蛋白酶結(jié)合使用。原因是鈣和鎂等金屬離子會(huì)降低胰酶的活性，因此在使用胰蛋白酶消化液時(shí)應(yīng)添加EDTA。它可以螯合這些離子并消除胰酶的抑制作用。

二、EDTA-胰蛋白酶的配制實(shí)驗(yàn)所需材料及試劑：

PBS,氫氧化鈉,EDTA,

三、EDTA-胰蛋白酶的配制實(shí)驗(yàn)步驟：

1.磷酸酶的質(zhì)量/體積比為0.25％，即將0.25g磷酸酶注入100毫升PBS中。注意，盡量不要用水溶解，因?yàn)楸仨毐３譂B透壓。

2. EDTA工作溶液的溶解度為0.02％-0.1％，可根據(jù)細(xì)胞消化的難度進(jìn)行調(diào)整。不需要EDTA，可以省略易于消化的細(xì)胞。 EDTA對(duì)細(xì)胞粘附有影響，因此應(yīng)大量使用。如果影響粘附，則必須將其用于消化，在用完全培養(yǎng)基終止消化后，離心并棄去上清液，然后添加完全培養(yǎng)基以進(jìn)行培養(yǎng)以除去EDTA。如果不影響附著力，則不要離心。

3. EDTA的濃度也是質(zhì)量體積比。用磷酸酶稀釋PBS。

4.請(qǐng)注意，血清可以阻止血漿酶的作用，但不能阻止EDTA。對(duì)于某些細(xì)胞，有必要在消化后停止離心。

5.當(dāng)pH約為8時(shí)，磷酸酶和EDTA最易溶解。在制備過程中，您可以先滴幾滴氫氧化鈉以將pH調(diào)整為8。請(qǐng)注意，磷酸酶會(huì)使溶液變酸，因此您應(yīng)隨時(shí)溶解時(shí)測(cè)量pH值。調(diào)整。請(qǐng)注意，不應(yīng)添加過量的氫氧化鈉，否則電池將無法承受堿的作用。

6.磷酸酶EDTA相對(duì)不溶。可以用磁力攪拌器攪拌，或?qū)⑵渲糜?度的冰箱中，溶解后過濾并滅菌。

7.可配備2-3倍血漿酶，節(jié)省時(shí)間和過濾器。使用時(shí)，請(qǐng)對(duì)PBS消毒。

8.將儲(chǔ)存溶液儲(chǔ)存在-20°C的冰箱中，然后將溶液儲(chǔ)存在4°C。使用時(shí)，請(qǐng)勿將其放在27°C的水浴中，因?yàn)檫@會(huì)使自由基酶迅速無法使用。使用前放置一次。是的，因?yàn)樘砑拥臄?shù)量很少，因此通常不會(huì)凍結(jié)細(xì)胞。

9.在消化過程中，向培養(yǎng)瓶中加入適量的胰酶。個(gè)人經(jīng)驗(yàn)，一般在10cm培養(yǎng)皿中加0.5ml。加入后，立即搖動(dòng)培養(yǎng)皿蓋住胰酶。一旦充滿，用負(fù)壓吸引多余的胰酶排出，將其加入37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行消化。

10.請(qǐng)注意，過量的胰酶對(duì)細(xì)胞有害，而過量的EDTA也會(huì)影響粘附，因此無需將細(xì)胞浸入血漿酶中進(jìn)行消化。

11.磷酸酶37具有最佳的消化作用，并具有在37度以下消化的能力。在消化過程中，甚至不需要將一些易于消化的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中。請(qǐng)注意，它不能消化太長時(shí)間。

四、實(shí)驗(yàn)所需試劑清單：

序列 產(chǎn)品名 ? ? ? ? ? ? 貨號(hào) CAS 備注

1 1000ul藍(lán)吸頭 FT-1000

2 氫氧化鈉 JT8650 1310-73-2

3 PBS ? ? ? ? ? ? HC1488

4 EDTA ? ? ? ? ? ? JH0691 600-00-4

5 chelex 100 SS6072

?案例：

Effect of trypsin-EDTA treatment on TnT. ( a ) An intact spheroid and a TnT connected cell before trypsin addition. ( b – c ) Dissociation of cells in the spheroid after 12 mins of trypsin addition. Two z -planes normal to the imaging axis have been imaged. ( d – e ) The TnT (shown by arrow) can be seen to be intact. ( e ′ ) Inset shows a close up of the TnT. The trapped cell always remains in focus. All scale bars, 20 μ m.?