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FluidicLab微流控實驗室:制備mRNA-LNP中常見問題處理

2023-02-24 17:27 作者:FluidicLab微流控實驗室  | 我要投稿


一、使用LNP-B0芯片按照Moderna或者Pfizer的公開配方制備mRNA-LNP,DLS測量出現(xiàn)兩個峰,一個小于100 nm,另外一個峰大于1000 nm的峰,并且PDI大于0.2以上,應(yīng)該如何處理?

答:出現(xiàn)這種情況一般有三個原因:

1. 進(jìn)行DLS測量時測量杯壁上有劃痕,對于多次反復(fù)重復(fù)使用,并反復(fù)用吸水紙擦拭的測量杯,該現(xiàn)象更加明顯。當(dāng)激光打在測量杯表面時,測量杯表面會發(fā)生激光散射,造成測量有大顆粒的假象。

2. 總流速太快,水和乙醇高速混合時會有氣泡產(chǎn)生,測量時溶液中有微氣泡殘余。

3. 30倍稀釋后的LNP粒子濃度太低,背景信號占比比較高,造成PDI過大。

處理方法:

1. 一般不需要做額外處理,只要小于100 nm的峰形正常,經(jīng)過超濾濃縮后的LNP重新測量,大于1000 nn的峰基本上就會消失,PDI會降低到0.1左右,不會影響后續(xù)實驗。

2. 如果該情況繼續(xù)出現(xiàn)的話,降低總流速到3-4 ml/min,觀察是否有改善。


二、 制備的LNP粒徑和PDI均比較正常,但是轉(zhuǎn)染細(xì)胞后效率很差,應(yīng)該如何處理?

答:一般使用包含GFP mRNA的LNP轉(zhuǎn)染細(xì)胞后兩天內(nèi)即可觀察到明顯的熒光,以96孔板為例,單孔轉(zhuǎn)染對應(yīng)1 ug mRNA的LNP(最低可降低到0.1 ug), 轉(zhuǎn)染效率普遍在70%以上,如果沒有觀察到明顯的熒光,建議轉(zhuǎn)染細(xì)胞時使用無血清培養(yǎng)基。加入血清會大大降低轉(zhuǎn)染效率。


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