2021年第四季度，歐易生物單細(xì)胞測序客戶文章持續(xù)井噴，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，第四季度目前已經(jīng)接受了10+篇客戶文章。在這些客戶文章中，今天為大家?guī)淼倪@篇尤為特殊，該研究使用了單細(xì)胞RNA與單細(xì)胞ATAC雙平臺深度解析了小鼠胸腺、脾臟和淋巴結(jié)γ δ T細(xì)胞的異質(zhì)性圖譜特征。該研究是由暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)部生物醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究院/珠海市人民醫(yī)院尹芝南教授課題組（李振華博士后、楊全利博士后和唐欣博士后為論文第一作者，尹芝南教授和曹廣超副研究員為論文共同通訊作者）在Science Bulletin上在線發(fā)表的題為“Single-cell RNA-seq and chromatin accessibility profiling decipher the heterogeneity of mouse γ δ T cells”的研究論文，歐易生物資深技術(shù)支持巴永兵為本篇文章的署名作者。

?基本信息?

題目：Single-cell RNA-seq and chromatin accessibility profiling decipher the heterogeneity of mouse γ δ T cells

期刊：Science Bulletin

影響因子：11.78

發(fā)表時間：2021.11.16

材料：小鼠胸腺、脾臟和淋巴結(jié) γ δ T細(xì)胞

技術(shù)：歐易生物?10×Genomics scRNA-seq+scATAC-seq

?文章摘要?

γ δ T細(xì)胞具有重要的免疫監(jiān)視功能，其不同亞型在維持組織穩(wěn)態(tài)和局部免疫反應(yīng)中發(fā)揮不同作用，但是γ δ T細(xì)胞的異質(zhì)性尚未完全解析。本文作者對小鼠胸腺、脾臟和淋巴結(jié)中的γ δ T細(xì)胞開展了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和染色質(zhì)開放性組學(xué)分析，系統(tǒng)性解析了其異質(zhì)性。作者發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的γ δ T1（IFN-γ+）和T17（IL-17A+）亞群內(nèi)部也存在顯著的異質(zhì)性并推斷了其潛在調(diào)控機(jī)制。通過對胸腺γ δ T細(xì)胞進(jìn)行擬時序分析，作者構(gòu)建了其發(fā)育軌跡。有意思的是，作者發(fā)現(xiàn)胸腺中存在一群獨(dú)立于T1和T17的新亞群GZMA+ γ δ T細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)該亞群具有前體細(xì)胞特征。作者還通過SCENIC分析、轉(zhuǎn)錄因子識別基序富集發(fā)現(xiàn)了一個新的γ δ T17轉(zhuǎn)錄抑制因子NR1D1，并利用基因敲除小鼠進(jìn)行了驗(yàn)證。綜上，本文構(gòu)建了小鼠γ δ T單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜和單細(xì)胞染色質(zhì)開放性圖譜，為深入解析γ δ T細(xì)胞異質(zhì)性和亞群調(diào)控機(jī)制提供了寶貴的資源庫。

?具體研究內(nèi)容解析?

1.?基于scRNA-seq探究組織特異性的γ δ T細(xì)胞表達(dá)圖譜

Figure 1. 基于scRNA-seq分析γ δ T圖譜特征

Fig. 1a展示了該篇文章的取樣方案，作者基于MACS和FACS分選出小鼠胸腺、脾臟和淋巴結(jié)γ δ T細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序，三個樣本分別捕獲了5394、2702和4818個細(xì)胞。tSNE降維聚類發(fā)現(xiàn)，一些亞群在每個組織中均有廣泛分布，而有些亞群則展現(xiàn)出組織特異性特征，如C2主要存在于胸腺中，C6主要存在于脾臟中（Fig. 1c, d）。Fig. 1e展現(xiàn)了每個亞群的top marker gene。作者基于亞群特異性marker gene的表達(dá)、免疫相關(guān)基因表達(dá)模式和GSVA分析等進(jìn)一步闡述了γ δ T亞群的功能特征。值得注意的是，作者發(fā)現(xiàn)淋巴結(jié)和脾臟的γ δ T基因表達(dá)程序高度相似，而來自胸腺的γ δ T細(xì)胞與淋巴和脾臟的基因表達(dá)模式部分相似，提示γ δ T從胸腺向外周免疫器官的趨化遷移的特征（Fig. 1f）。

2. γ?δ?T1和γ?δ T17細(xì)胞的異質(zhì)性特征

Figure 2. γ?δ?T1和γ?δ?T17細(xì)胞的異質(zhì)性特征

根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞因子過程的不同，γ δ T主要可以分為γ δ T1（IFN-γ+）和T17（IL-17A+）兩種亞型。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Il17a主要表達(dá)于C3群，C5、C8和C9三個亞群主要表達(dá)IFN-γ（Fig. 2a, b）?；诓町惢驘釄D和代謝功能分析發(fā)現(xiàn)（Fig. 2c）， γ δ T1細(xì)胞高表達(dá)趨化因子、細(xì)胞毒性和脂代謝相關(guān)基因，γ δ T17高表達(dá)炎癥反應(yīng)、胸腺細(xì)胞遷移和糖酵解相關(guān)基因，表明γ δ T1和γ δ T17的功能異質(zhì)性。為了進(jìn)一步探究兩者功能的差異，作者對γ δ T1和γ δ T17進(jìn)行SCENIC分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如調(diào)控IFN-γ表達(dá)的調(diào)控子Stat1在γ δ T1中高富集，調(diào)控IL-17A表達(dá)的Maf/Rorc在γ δ T1中高表達(dá)，與預(yù)期相符。此外，作者發(fā)現(xiàn)了一些潛在可能區(qū)分調(diào)控γ δ T1和γ δ T17的轉(zhuǎn)錄因子，例如與γ δ T1相比，Rora在γ δ T17中調(diào)控活性明顯較高（Fig. 2d）。

為了進(jìn)一步闡明γ δ T1和γ δ T17的異質(zhì)性特征，作者對這兩個亞型分別進(jìn)行了降維聚類分析。對于γ δ T17，作者將γ δ T17分了5個亞群，并根據(jù)亞群特征性基因的表達(dá)，對每個亞群進(jìn)行了功能注釋。值得注意的是，胸腺中γ δ T17展現(xiàn)出明顯的異質(zhì)性特征（包括Sell high / Cd44 low群，Scart2 high / Il17f high群和Scart1 high / Trdv4 high群），尤其是Scart2 high / Il17f high群和Scart1 high / Trdv4 high群展現(xiàn)出胸腺組織特異性且分別高表達(dá)淋巴細(xì)胞分化和ER局部蛋白復(fù)合物功能相關(guān)基因（Fig. 2f-2h），表明這兩個群體可能遷移到淋巴組織中，并繼續(xù)分化成具有特定轉(zhuǎn)錄特征的新亞群。同樣地，作者對γ δ T1進(jìn)行類似分析（Fig. 2i-2k）。

3. 基于單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序重塑胸腺γ?δ T細(xì)胞發(fā)育軌跡

Figure 3. 基于擬時序分析重塑γ δ T細(xì)胞發(fā)育軌跡

為進(jìn)一步探究胸腺中γ?δ T細(xì)胞的發(fā)育特征，作者基于monocle2對胸腺γ?δ T細(xì)胞進(jìn)行擬時序分析（Fig. 3b-3e）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)cluster和擬時序產(chǎn)生的state可以很好的對應(yīng)在一起，并進(jìn)一步構(gòu)建了胸腺γ?δ T細(xì)胞基因變化熱圖和功能變化特征（Fig. 3f）。依據(jù)于擬時序時間順序關(guān)系，作者將胸腺T細(xì)胞分為三個發(fā)育階段：未成熟期（對應(yīng)Fig. 3f熱圖module3和module4功能特征）、過渡期（對應(yīng)module1功能特征）和成熟期（對應(yīng)module2功能特征）。該發(fā)育軌跡的構(gòu)建，有助于深入了解γ?δ T細(xì)胞的發(fā)育過程和潛在的調(diào)控基礎(chǔ)。

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4.?發(fā)現(xiàn)胸腺中獨(dú)特的功能亞群Gzma+ γ?δ T cells

?Figure 4. 胸腺中獨(dú)特的功能亞群Gzma+ γδ 細(xì)胞

作者發(fā)現(xiàn)，約85%的胸腺γ δ T為Gzma表達(dá)陽性，而淋巴結(jié)和脾臟中γ δ T細(xì)胞Gzma陽性的比例很低（Fig. 4a-4d），表明Gzma+ γ δ T cells可能是特定存在于胸腺中的亞群。接下來，作者想要解析Gzma+ γ?δ T細(xì)胞和Ifng+?γ δ T細(xì)胞和Il17a+ γ δ T細(xì)胞三者的關(guān)系。基于SCENIC分析（Fig. 4j）和體外細(xì)胞因子染色結(jié)果（Fig. 4k-4l），染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)GZMA確實(shí)主要表達(dá)于胸腺γ?δ T中，而在淋巴結(jié)和脾臟中表達(dá)量較低，SCENIC結(jié)果則暗示Gzma+ γ δ T細(xì)胞主要表現(xiàn)非成熟階段的發(fā)育特征。以上結(jié)果表明，Gzma+ γ?δ T細(xì)胞可能是先于Ifng+?γ δ T細(xì)胞和Il17a+ γ δ T細(xì)胞存在的一類早期γ δ T細(xì)胞。

5. 基于單細(xì)胞ATAC測序探究組織特異性的γ δ T細(xì)胞染色質(zhì)可及性圖譜

Figure 5. 基于單細(xì)胞ATAC測序分析γ δ T圖譜特征

由于高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組在檢測低豐度基因包括轉(zhuǎn)錄因子上的不足，而開放區(qū)染色質(zhì)可及性可能在基因轉(zhuǎn)錄之前就已經(jīng)完成，因此ATAC測序?qū)ξ磥砘虻霓D(zhuǎn)錄活性具有預(yù)測價值。因此，這里作者同時對胸腺、脾臟和淋巴結(jié)的γ δ T細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞ATAC測序。Fig. 5a和Fig. 5b-5e分別展示實(shí)驗(yàn)流程和基于ATAC數(shù)據(jù)的降維聚類結(jié)果。結(jié)果同單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組類似，淋巴結(jié)和脾臟γ δ T細(xì)胞展現(xiàn)出了類似的染色質(zhì)開放性結(jié)果，而胸腺展現(xiàn)出了部分相似的特征，表明胸腺作為γ δ T細(xì)胞的主要發(fā)育器官，與周圍其他器官γ δ T細(xì)胞表達(dá)特征明顯不同。

6. 基于scATAC-seq測序重塑胸腺γ?δ T細(xì)胞發(fā)育譜系

Figure 6.基于scATAC-seq測序重塑胸腺γ δ T細(xì)胞發(fā)育譜系

在scRNA-seq部分，作者基于monocle2構(gòu)建了胸腺γ δ T細(xì)胞的發(fā)育軌跡，在scATAC-seq部分作者同樣利用ArchR重塑了胸腺γ δ T細(xì)胞的發(fā)育軌跡（Fig. 6a-6b）。Fig. 6c和Fig. 6d通過熱圖分別展示出隨著發(fā)育軌跡基因活性和motif富集TF的變化軌跡。與scRNA-seq的結(jié)果一致，在胸腺γ δ T細(xì)胞發(fā)育早期，Gzma基因位點(diǎn)隨著TCF3-motif的富集而活躍。在T和B細(xì)胞發(fā)育過程中，TCF3通過順式調(diào)節(jié)模塊的結(jié)合位點(diǎn)調(diào)控Rag的表達(dá)，并激活多種增強(qiáng)子。作者推測，TCF3可能是促進(jìn)γ δ T細(xì)胞發(fā)育和/或分化的重要表觀遺傳調(diào)節(jié)因子。

7. scRNA-seq和scATAC-seq整合分析以及NR1D1敲除驗(yàn)證

Figure 7.scRNA-seq和scATAC-seq整合分析

整合分析發(fā)現(xiàn)，無論是scRNA-seq還是scATAC-seq結(jié)果，Il17a+、Ifng+和Gzma+ γ δ T三個亞群之間降維聚類分布很少有重疊部分（Fig. 7a-7b），表明這三個亞群之間功能上存在很大的不同。scRNA-seq和scATAC-seq數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，Il17a+ γ δ T細(xì)胞亞群具有獨(dú)特的特性，在轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳基礎(chǔ)上顯示出更好的匹配程度（Fig. 7c），提示Il17a+ γ δ T細(xì)胞亞群的高度異質(zhì)性早在關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控之前的染色質(zhì)狀態(tài)就已確定。接下來，作者試圖尋找調(diào)控Il17a+ γ δ T分化和發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，基于scRNA-seq的SCENIC結(jié)果篩選以及scATAC-seq中motif TF富集（Fig. 8a-8b），作者將目標(biāo)放在了可能調(diào)控Il17a+ γ δ T發(fā)育的潛在轉(zhuǎn)錄因子NR1D1。接下來，作者利用NR1D1基因敲除小鼠進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲除前后γ δ T細(xì)胞的比例并未發(fā)生變化（Fig. 8c），表明NR1D1在γ δ T的分化和發(fā)育中并不是必需的。值得注意的是，相對于正常組，敲除組小鼠產(chǎn)生了更高比例的IL-17A，表明NR1D1可以特異性的抑制γ δ T17細(xì)胞的分化。

Figure 8.NR1D1敲除驗(yàn)證

?參考文獻(xiàn)?

Zhenhua Li, Quanli Yang, Xin Tang, Yiming Chen, Shanshan Wang, Xiaojie Qi, Yawen Zhang, Zonghua Liu, Jing Luo, Hui Liu, Yongbing Ba, Lianxia Guo, Baojian Wu, Fang Huang, Guangchao Cao, Zhinan Yin,Single-cell RNA-seq and chromatin accessibility profiling decipher the heterogeneity of mouse γδ T cells,Science Bulletin,2021.?

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END

憂郁的艾迪? ?撰文

本文系歐易生物原創(chuàng)

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