第5章 蛋白質(zhì)分離與純化

一、簡答

1.簡述離子交換層析、親和層析、凝膠過濾、疏水層析分離的原理及樣品洗脫方法？

答：（1）離子交換層析：是一種用離子交換樹脂作支持劑的層析方法。

洗脫方法：蛋白質(zhì)混合物的分離可以由改變?nèi)芤褐械柠}離子強(qiáng)度和pH來完成，對離子交換劑結(jié)合力最小的蛋白質(zhì)首先從層析住中洗脫出來。層析洗脫，可以采用保持洗脫液成分一直不變的方法，也可以采用改變洗脫的鹽濃度或和pH的方式洗脫。

（2）親和層析：是把待純化的某一蛋白質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價地連接到像瓊脂糖凝膠一類的載體表面的功能基上。

洗脫方法：當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)混合物加到填有親和介質(zhì)的層析柱時，待純化的某一蛋白質(zhì)則被吸附在含配體的瓊脂糖顆粒表面上而其他的蛋白質(zhì)（稱雜蛋白）則因?qū)υ撆潴w無特意的結(jié)合部位而不被吸附，他們通過洗滌即可除去，被特異結(jié)合的蛋白質(zhì)可用含游離的相應(yīng)配體溶液把它從柱上洗脫下來。

（3）凝膠過濾：當(dāng)不同分子大小的蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠柱層析柱時，比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下移動并最先流出柱外；比網(wǎng)孔小的分子不能同程度的自由出入凝膠珠內(nèi)外，這樣由于不同大小的分子所經(jīng)的路徑不同而得到的分離，大分子物質(zhì)先被洗脫出來，小分子物質(zhì)后被洗脫出來。

（4）疏水層析分離：就是根據(jù)蛋白質(zhì)表面的疏水性差別，在疏水作用層析中，不是暴露的疏水基團(tuán)促進(jìn)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，而是連接在支持介質(zhì)上的疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)表面上暴露的疏水基團(tuán)結(jié)合。

洗脫方法：由于疏水作用層析要求鹽析化合物如硫酸銨的存在以促進(jìn)蛋白質(zhì)分子的疏水區(qū)域暴露。為使吸附達(dá)到最大，可將蛋白質(zhì)樣品的pH調(diào)至等電點(diǎn)附近。一旦蛋白質(zhì)吸附于固定相，則可利用多種方式進(jìn)行選擇洗脫，包括使用逐漸降低離子強(qiáng)度或增加pH的洗脫液（增加蛋白質(zhì)的親水性），或使用對固定相的親和力比對蛋白質(zhì)更強(qiáng)的置換劑進(jìn)行置換洗脫。

?測定蛋白質(zhì)分子量方法有哪些，列舉3種？

滲透壓法測定分子量；沉降分析法測定分子量；凝膠過濾法測定分子量

化學(xué)組成法， 凝膠過濾法， SDS-PAGE法

1.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 2.凝膠過濾 3.質(zhì)譜----質(zhì)譜是目前最為精確的分子量測定方法。

首先將蛋白質(zhì)變成高速帶電離子流，然后蛋白離子在真空電場中運(yùn)動，在重力作用下偏轉(zhuǎn)，蛋白離子在電場中偏轉(zhuǎn)的距離與其分子量成比例關(guān)系。在質(zhì)譜分析方法中，蛋白質(zhì)分子的離子化是關(guān)鍵的技術(shù)。

?什么是蛋白質(zhì)組，研究蛋白組常用的方法是什么。

某一組合細(xì)胞表達(dá)的全部蛋白---蛋白質(zhì)組

?雙向電泳

?質(zhì)譜

?蛋白質(zhì)芯片

?酵母雙雜交

?常用的蛋白質(zhì)沉淀方法有哪些（列三種）。

1.鹽析法：加入高濃度的中性鹽（如[H4N]2SO4、Na2SO3 、NaCl等），可有效破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化層，同時又中和了蛋白質(zhì)的電荷，使蛋白質(zhì)產(chǎn)生沉淀

2.金屬鹽沉淀法：當(dāng)溶液pH值高于等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)顆粒帶負(fù)電荷，它易與重金屬離子（Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+）結(jié)合成不溶性鹽而沉淀

3.有機(jī)溶劑沉淀法：可與水混合的有機(jī)溶劑，如酒精、甲醇、丙酮等，對水的親和力很大，能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，使蛋白質(zhì)顆粒容易凝集而沉淀。

4.生物堿試劑和某些酸類沉淀法：pH小于等電點(diǎn)時蛋白質(zhì)帶正電荷，易與帶負(fù)電（酸根陰離子）的生物堿試劑(如苦味酸、鎢酸、鞣酸)以及某些酸(如三氯醋酸、過氯酸、硝酸) 生成不溶性鹽而沉淀。

5.加熱變性沉淀

?列舉三種測定蛋白質(zhì)含量的方法。

? 1.凱氏定氮法 2.雙縮脲法 3.Flin-酚試劑法 4.紫外吸收法 5.染料結(jié)合法 6.膠體全測定法