1.?68℃烘烤45-60 min。

2.?脫蠟至水。

3.?抗原修復(fù)：加稀釋好的1L EDTA抗原修復(fù)液（根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)選擇EDTA或者檸檬酸鹽）到高壓鍋，2100W煮沸后加入切片，蓋上高壓鍋蓋子，功率調(diào)制1000W。氣閥旋轉(zhuǎn)時(shí)/開(kāi)始噴氣開(kāi)始計(jì)時(shí)2.5min，高壓鍋放入水盆中冷卻，流水激氣閥，打開(kāi)高壓鍋的蓋子，晾20min至室溫。

4.?PBS洗，3*5min。

5.?3% H2O2 孵育10min，RT（去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶）。

6.?PBS洗，3*5min。

7.?封閉：山羊血清（如需破膜，封閉液重加入0.1%的Triton X-100）或免疫染色封閉液，RT孵育0.5-1.5h（具體的時(shí)間需要根據(jù)所用試劑的說(shuō)明書(shū)）。

8.?一抗4℃孵育盒重過(guò)夜（18h）。

9.?RT或37℃復(fù)溫45min。

10. PBST洗3*5min。

11. 二抗 RT孵育30min。

12.?PBST洗3*5min。

13.?稀釋好的DAB（1滴加入到1mL DAB稀釋液中）孵育30s-3min（加入DAB后馬上放在鏡下觀察，至陽(yáng)性區(qū)域呈現(xiàn)明顯的棕色，而背景未著色）。

14.?水洗。

15.?復(fù)染：蘇木精 30s → 水洗 → 鹽酸酒精 2-5s →自來(lái)水泛藍(lán)10min → 脫水透明：75%，85%，95%，100%I，100%II →三缸二甲苯各5min。

16.?封片。

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