在將Sulfo-Cy3 alkyne與細(xì)胞膜偶聯(lián)的實(shí)驗(yàn)中，需要使用點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，通過炔基與含有Azide官能團(tuán)的細(xì)胞膜分子進(jìn)行特異性共價(jià)結(jié)合。以下是一種常用的細(xì)胞膜偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)方法：

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實(shí)驗(yàn)步驟：

1. 細(xì)胞培養(yǎng)和處理：

???- 選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細(xì)胞至合適的密度和狀態(tài)。

???- 轉(zhuǎn)染細(xì)胞（如需要），使細(xì)胞表達(dá)帶有Azide官能團(tuán)的膜蛋白（例如，膜蛋白表達(dá)的GFP-Azide融合蛋白）。

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2. Sulfo-Cy3 alkyne的添加：

???- 準(zhǔn)備Sulfo-Cy3 alkyne熒光探針的工作溶液。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和細(xì)胞處理數(shù)量來確定適當(dāng)?shù)臐舛取?/p>

???- 將Sulfo-Cy3 alkyne溶液加入培養(yǎng)皿中，并充分混合。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中直接加入或通過洗滌細(xì)胞的方式加入。

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3. 培養(yǎng)和點(diǎn)擊反應(yīng)：

???- 孵育細(xì)胞在適當(dāng)?shù)臏囟群虲O2濃度下，通常為37°C，5% CO2，持續(xù)培養(yǎng)一定的時間，例如30分鐘至1小時。

???- Sulfo-Cy3 alkyne熒光探針與細(xì)胞膜上含有Azide官能團(tuán)的分子進(jìn)行點(diǎn)擊反應(yīng)。點(diǎn)擊反應(yīng)需要銅離子催化劑。可以使用點(diǎn)擊化學(xué)試劑盒，其中包含點(diǎn)擊反應(yīng)所需的配體和催化劑。

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4. 細(xì)胞處理和成像：

???- 洗滌細(xì)胞，去除未反應(yīng)的探針和剩余的點(diǎn)擊反應(yīng)試劑。

???- 添加適當(dāng)?shù)募?xì)胞培養(yǎng)基，以保持細(xì)胞在適宜的條件下進(jìn)行成像。

???- 使用熒光顯微鏡或其他適合的熒光成像設(shè)備觀察細(xì)胞樣品。Sulfo-Cy3 alkyne在熒光通道中產(chǎn)生紅色的熒光信號，可以顯示細(xì)胞膜偶聯(lián)的情況。

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需要注意的是，點(diǎn)擊反應(yīng)需要一定的時間進(jìn)行反應(yīng)，但時間過長可能會引起細(xì)胞毒性或損傷。因此，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中應(yīng)仔細(xì)控制點(diǎn)擊反應(yīng)時間。此外，對于細(xì)胞膜的選擇性偶聯(lián)，還應(yīng)在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置合適的對照組，以確保偶聯(lián)的特異性和準(zhǔn)確性。

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CY5 COOH

Sulfo-CY7 tetrazine

CY3 amine

Sulfo-CY3 amine

CY5.5 NHS ester

Sulfo-CY5 COOH

CY7.5 maleimide

Sulfo-CY7 maleimide

SiR-PEG4-DBCO

SiR-PEG4-tetrazine

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