研究背景

腎細(xì)胞癌 (RCC) 是世界上診斷最多的十種癌癥之一，包括多種組織學(xué)和遺傳亞型。透明細(xì)胞 RCC (ccRCC) 占腎癌相關(guān)死亡的大部分。雖然局部的治療是手術(shù)切除或消融，但晚期疾病的治療選擇受到限制。然而，靶向治療對(duì)腫瘤抑制和個(gè)體患者的生存有不同的影響，這意味著需要更新的選擇來(lái)改善患者的預(yù)后。

2023年01月09日，圣路易斯華盛頓大學(xué)醫(yī)學(xué)院丁莉(Li Ding)教授領(lǐng)銜，近30個(gè)合作機(jī)構(gòu)合作在Cancer Cell期刊（IF:38.58）發(fā)表的題為 的研究成果，文章采用多組學(xué)（組織病理學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、單細(xì)胞測(cè)序、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤代謝組學(xué)以及腫瘤特異性糖蛋白組學(xué)）聯(lián)合研究方法，整合來(lái)自305個(gè)腫瘤節(jié)段的組織病理學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的瘤內(nèi)異質(zhì)性特征以及 UCHL1 的預(yù)后價(jià)值。對(duì)侵襲性組織病理學(xué)亞型進(jìn)行分子分層型，有望成為一種有效的治療策略。

研究背景

腎細(xì)胞癌 (RCC) 的探究與基因缺陷、疾病進(jìn)展和更具侵襲性的表型有關(guān)。癌癥基因組圖譜 (TCGA)分析突出了與患者結(jié)果相關(guān)的多種代謝途徑中的腫瘤特異性變化。其中單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析現(xiàn)在可以更高分辨率地了解 ccRCC 中的腫瘤微環(huán)境 (TME)。

為了研究與 ccRCC 患者預(yù)后相關(guān)的代謝異常，作者首先分析了 50 個(gè)腫瘤和 7 個(gè)正常鄰近組織 (NAT) 的代謝組譜，隨后檢查了 56 個(gè)腫瘤和 15 個(gè) NAT的驗(yàn)證集。按照評(píng)估 ccRCC 異質(zhì)性的最新方法進(jìn)行了廣泛的腫瘤組織病理學(xué)評(píng)估。蛋白質(zhì)組學(xué)分析也得到擴(kuò)展，包括從蛋白質(zhì)組學(xué)到磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)和糖蛋白質(zhì)組學(xué)。這些發(fā)現(xiàn)應(yīng)該有助于臨床轉(zhuǎn)化，包括闡明預(yù)期的患者結(jié)果依賴性特征和治療目標(biāo)，以幫助對(duì) ccRCC 患者進(jìn)行個(gè)性化治療。

研究思路

研究結(jié)果

1.研究設(shè)計(jì)、隊(duì)列和數(shù)據(jù)類型概述

研究將隊(duì)列規(guī)模為 213 個(gè)病例，其中 40 個(gè)病例被選擇用于另外多片段分析，以評(píng)估腫瘤演變。該數(shù)據(jù)集包含來(lái)自初始 (INI)、擴(kuò)展 (EXP) 和 ITH 隊(duì)列的 16 種不同數(shù)據(jù)類型的 305 個(gè)腫瘤樣本、165 個(gè)配對(duì) NAT 和 213 個(gè)血液正常樣本（圖 1A）。樣本的基因組和表觀遺傳學(xué)特征與之前一樣， 而新增的 110 個(gè)樣本用于基于DIA 蛋白質(zhì)組學(xué)分析（圖 1A）。將 106 個(gè)選定病例的代謝組學(xué)和來(lái)自 7 個(gè)病例的 15 個(gè)腫瘤標(biāo)本的RNA 測(cè)序 (snRNA-seq) 與其他多組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合，有助于研究腫瘤固有細(xì)胞群和 TME（圖 1A）。同時(shí)，基于 21 個(gè)參數(shù)進(jìn)行了全面的組織病理學(xué)評(píng)估，以確定低級(jí)和高級(jí)特征、空間結(jié)構(gòu)和 TME。整合分子譜和組織病理學(xué)注釋以表征不同的組織學(xué)特征，了解驅(qū)動(dòng) ccRCC 的分子機(jī)制，并為選擇有效治療提供參考。

圖1 |?ccRCC 組織病理學(xué)異質(zhì)性的分子基礎(chǔ)

2.ccRCC 蛋白質(zhì)組學(xué)和 TME ITH 多段綜合分析表征

為了研究組織病理學(xué)特征和分子特征之間的關(guān)聯(lián)以更深入地了解 ccRCC ITH，作者生成了來(lái)自 40 名患者的 132 個(gè)腫瘤節(jié)段的多組學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，并進(jìn)行了綜合分析（圖 2A）。根據(jù) HGFC 的方差對(duì)案例進(jìn)行排序（圖 2B），作者觀察到不同級(jí)別的異質(zhì)性（圖 2B）?？傮w而言，w I-ITH 組表現(xiàn)出高水平的免疫 ITH。

免疫呈遞的異質(zhì)性可能會(huì)影響免疫治療反應(yīng)，并最終導(dǎo)致治療失敗或治療選擇不當(dāng)?；?Panoptes 的多分辨率神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型經(jīng)過(guò)訓(xùn)練以預(yù)測(cè)基于 H&E 的免疫亞型，還提供了轉(zhuǎn)錄組免疫亞型數(shù)據(jù)。它們顯示出免疫亞型預(yù)測(cè)的高度一致性（圖 2F）。

圖2 |?通過(guò)多段綜合分析對(duì) ccRCC 蛋白質(zhì)組學(xué)和 TME ITH 進(jìn)行表征

3.單細(xì)胞分析確定了 ITH、肉瘤樣和橫紋肌樣的表達(dá)特征

作者通過(guò) snRNA-seq 研究了根據(jù)某些特征選擇的四個(gè)病例的 12 個(gè)腫瘤節(jié)段的轉(zhuǎn)錄組。作者進(jìn)一步注釋了這些腫瘤亞群，從 snRNA-seq 推斷的 CNV 和從顯微切割的橫紋肌樣和透明細(xì)胞區(qū)域獲得的基于全外顯子組測(cè)序 (WES) 的 CNV（圖 3E）推斷。使用這些具有代表性的基因組改變和標(biāo)記表達(dá)為特征相關(guān)子集群注釋提供額外的證據(jù)。

為了進(jìn)一步加強(qiáng)和驗(yàn)證作者的觀察結(jié)果，作者對(duì)另外兩個(gè)肉瘤樣細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序snRNA-seq 整合分析（圖 4B）。并通過(guò)免疫組織化學(xué) (IHC) 驗(yàn)證了兩個(gè)代表性病例中的 TGFBI 表達(dá)，由此作者僅在肉瘤樣區(qū)域看到信號(hào)（高染色和彌散染色），而不是在傳統(tǒng)的嵌套透明細(xì)胞區(qū)域（圖 4D）。至于 C3N01287 中具有橫紋肌樣特征的子簇，它呈現(xiàn)出更高的 KIF2A、NAMPT 和 GALNT2 表達(dá)譜（圖 4E），并被另一個(gè)具有橫紋肌樣特征的獨(dú)立病例證實(shí)（圖 4F）。

圖3 |單核 RNA-seq 圖譜識(shí)別不同的腫瘤內(nèi)上皮細(xì)胞群

圖4 | snRNA-seq atlas 進(jìn)一步細(xì)化肉瘤樣和橫紋肌樣組織學(xué)相關(guān)基因表達(dá)特征

4.ADNA 高甲基化 Methyl1 亞型與 BAP1 突變和與生存率低相關(guān)的各種其他特征相關(guān)

表觀遺傳 DNA 甲基化標(biāo)記的失調(diào)被認(rèn)為是致癌作用的早期，作者通過(guò)擴(kuò)展隊(duì)列進(jìn)行探索。作者發(fā)現(xiàn) 235 個(gè)常見(jiàn)的顯著 DM 探針對(duì)應(yīng)于 198 個(gè)基因，與同源基因表達(dá)呈整體負(fù)相關(guān)（圖 5C）。

為了了解每個(gè)甲基化亞型的特征，作者對(duì) RNA 水平和蛋白質(zhì)豐度進(jìn)行了 DE 分析。最后，作者在 16 個(gè)獨(dú)立的臨床侵襲性病例之一中對(duì) UCHL1 染色進(jìn)行了拓?fù)鋵W(xué)表征，這些病例表現(xiàn)出形態(tài)學(xué)異質(zhì)性（圖 5I），其中橫紋肌樣結(jié)節(jié)和高級(jí)別腫瘤分別顯示強(qiáng)和中度 UCHL1 染色，而染色呈陰性低級(jí)別透明細(xì)胞區(qū)域（圖 5J）。因此，作者能夠證明 UCHL1 表達(dá)與 ITH 的協(xié)同。

圖5 | DNA 高甲基化 Methyl1 亞型與 BAP1 突變和與生存率低相關(guān)的各種其他特征相關(guān)

5.ccRCC 中的關(guān)鍵磷酸化信號(hào)通路和激酶底物相互作用

為了識(shí)別 ccRCC 中的關(guān)鍵磷酸化信號(hào)通路，作者的磷酸化蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)集包含 110 個(gè)基于 DIA 的 EXP 隊(duì)列病例和 103 個(gè)基于 TMT 方法的 INI 隊(duì)列病例13（圖 6A）。使用來(lái)自 110 個(gè)腫瘤的變異系數(shù) (CV) 的磷酸化事件來(lái)構(gòu)建?；谀[瘤磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的揭示了磷酸化亞型的不同特征（圖 6C）。MAPK14 和 MAPKAPK2 在 P1 中顯著富集。

研究重點(diǎn)關(guān)注先前優(yōu)先考慮的一組六個(gè) K-S 對(duì)（圖 6D）。作者通過(guò)基于 DIA 蛋白質(zhì)組學(xué)的質(zhì)譜法表征了用針對(duì) MAPK、EGFR、mTOR 信號(hào)和 WEE1 的抑制劑處理的五種 RCC 細(xì)胞系的磷酸化蛋白質(zhì)組。根據(jù)下游靶向底物的磷酸化水平，觀察到細(xì)胞系之間抑制作用的變化。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了腫瘤中激活的多個(gè)信號(hào)通路，并揭示了 ccRCC 中與獨(dú)特的 K-S 對(duì)相關(guān)聯(lián)的四個(gè)主要磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)組。

圖6 |ccRCC 組織中關(guān)鍵磷酸信號(hào)通路、激酶-底物 (K-S) 相互作用的鑒定，以及來(lái)自 RCC 細(xì)胞系的離體激酶藥物抑制數(shù)據(jù)的整合

6.ccRCC 和高級(jí)別 ccRCC 特異性蛋白質(zhì)糖基化的改變

癌癥中細(xì)胞表面蛋白的異常糖基化會(huì)影響各種生物學(xué)功能。?在探索糖蛋白組學(xué)數(shù)據(jù)中的瘤間異質(zhì)性時(shí)，作者觀察到三種主要的 ccRCC 糖蛋白組學(xué)亞型（Glyco1-3，圖 7E）和三個(gè)完整的糖肽簇（IPC 1-3，圖 S6C）。此外，作者使用 CPTAC ccRCC 和 TCGA KIRC 隊(duì)列檢查了 HYOU1 表達(dá)與存活之間的關(guān)聯(lián)。HYOU1 豐度只能在 CPTAC 隊(duì)列中的蛋白質(zhì)水平上作為潛在的預(yù)后指標(biāo)，而不是在兩個(gè)隊(duì)列中的 RNA 水平上（圖 7G），針對(duì)唾液酸化聚糖的靶向治療可能是 Glyco2 和 Glyco3 亞型的潛在替代方法。?

圖7 | ccRCC 和高級(jí)別 ccRCC 特有的蛋白質(zhì)糖基化改變

7.?高級(jí)別 ccRCC 和低級(jí)別 ccRCC 的代謝特征

重新編程的腫瘤代謝是癌癥的標(biāo)志，腎癌與代謝組學(xué)改變密切相關(guān)。從 50 個(gè) ccRCC 和七個(gè) NAT 中量化了各種代謝途徑中的 183 種代謝物。主成分分析 (PCA) 發(fā)現(xiàn)腫瘤和 NAT 之間存在明確的分離（圖 8A）。作者檢測(cè)到 55 種具有顯著更高腫瘤特異性豐度的代謝物。此外，CH 和 CL 腫瘤的代謝特征顯著不同（圖 8A–8C）。

結(jié)合代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，作者將代謝物的表達(dá)與其酶相關(guān)聯(lián)，并將代謝組學(xué)與途徑、分子和組織病理學(xué)特征以及臨床信息相關(guān)聯(lián)。研究分析抑制谷氨酰胺分解是一種潛在的癌癥療法，而 GLUL 可能是一個(gè)治療靶點(diǎn)?；诿枋鏊锌捎媒M學(xué)層的綜合特征，作者發(fā)現(xiàn) 50 個(gè)腫瘤中有 48 個(gè)呈現(xiàn)出獨(dú)特的特征特征，證明了 ccRCC 中強(qiáng)烈的腫瘤間異質(zhì)性（圖 8H）。

圖8 | 高級(jí)別和低級(jí)別 ccRCC 中失調(diào)的代謝

研究結(jié)論

ccRCC 是一種由組織病理學(xué)特征定義的復(fù)雜疾病，通過(guò)越來(lái)越多地使用不同的分析方法，其變異性和異質(zhì)性水平不斷提高。在初始 CPTAC 研究的基礎(chǔ)上，本研究擴(kuò)大了患者隊(duì)列和分析，包括增強(qiáng)的組織病理學(xué)、多樣本腫瘤的蛋白質(zhì)組學(xué)、單細(xì)胞測(cè)序、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析、腫瘤代謝組學(xué)以及腫瘤特異性糖蛋白組學(xué)的首次分析。這項(xiàng)研究的多組學(xué)性質(zhì)突出了 ccRCC 中存在的瘤間異質(zhì)性。盡管存在異質(zhì)性，作者還是證明了高級(jí)別腫瘤中特定蛋白質(zhì)組學(xué)特征的富集，包括不同的磷酸化和糖蛋白特征，并確認(rèn)了一些特征，這些特征以前與不良患者預(yù)后相關(guān)。

這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了可通過(guò)?IHC 測(cè)量 UCHL1 表達(dá)，作為具有 BAP1 突變、基因組不穩(wěn)定的腫瘤的臨床和治療管理的高級(jí)別腫瘤的潛在生物標(biāo)志物。作者基于對(duì) ccRCC 的形態(tài)學(xué)評(píng)估最新進(jìn)展，對(duì)ccRCC 進(jìn)行了全面的組織病理學(xué)表征。糖蛋白 HYOU1?在高級(jí)別腫瘤 ccRCC 中的表達(dá)增加及其與不良生存率的相關(guān)性使其成為潛在的治療靶點(diǎn)和生物標(biāo)志物，并且這些相關(guān)性已在其他癌癥類型中發(fā)現(xiàn)。值得注意的是，這一觀察結(jié)果在 RNA 表達(dá)水平上無(wú)法檢測(cè)到，并強(qiáng)調(diào)了多組學(xué)蛋白質(zhì)分析在識(shí)別潛在的基于 IHC 的生物標(biāo)志物方面的能力。糖蛋白的腫瘤特異性表達(dá)改變與各種癌癥的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)，并被認(rèn)為是治療靶點(diǎn)。最后，代謝組分析證實(shí)，在高級(jí)別 ccRCC 中，尿素循環(huán)中谷氨酰胺和代謝物的豐度增加，目前，這兩項(xiàng)觀察結(jié)果都被視為治療目標(biāo)。

總而言之，這項(xiàng)研究利用多種分析方法增強(qiáng)了作者對(duì)這種復(fù)雜和異質(zhì)性疾病的理解。組織學(xué)異質(zhì)性的觀察與潛在的分子異質(zhì)性密切相關(guān)，但分子異質(zhì)性也超出了在可視化組織水平上觀察到的異質(zhì)性。這項(xiàng)研究也提供了豐富的數(shù)據(jù)，將作為進(jìn)一步研究的寶貴資源，并描述了蛋白質(zhì)組學(xué)特征，這些特征可以推動(dòng)治療研究的轉(zhuǎn)化，以改善 ccRCC 患者的預(yù)后。

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本研究采用多組學(xué)（組織病理學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、單細(xì)胞測(cè)序、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、腫瘤代謝組學(xué)以及腫瘤特異性糖蛋白組學(xué)）技術(shù)，全面表征了ccRCC的復(fù)雜和異質(zhì)性。提示組織學(xué)異質(zhì)性的觀察與潛在的分子異質(zhì)性密切相關(guān)，這項(xiàng)研究也提供了豐富的數(shù)據(jù)，將作為進(jìn)一步研究的寶貴資源，值得借鑒和進(jìn)一步挖掘。

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