一、前言
? ? ? ? 蛋白-蛋白對(duì)接是一個(gè)既復(fù)雜又重要的話題。從一開始的基于FFTs算法的剛性對(duì)接ZDOCK發(fā)展到現(xiàn)在整合實(shí)驗(yàn)信息與多步驟優(yōu)化的HADDOCK、ClusPro、SwamDock等等的出現(xiàn)，該領(lǐng)域的算法一直不斷地升級(jí)迭代。
? ? ? ? RosettaDock是蛋白-蛋白對(duì)接領(lǐng)域的一名老將，久經(jīng)CAPRI的考驗(yàn)。特別擅長于蛋白-蛋白復(fù)合物局部構(gòu)象的探索。許多已發(fā)表的文章都是使用RosettaDock進(jìn)行最后的優(yōu)化，其地位可見一斑。
? ? ? ?近年來，RosettaDock也發(fā)展出了針對(duì)特殊蛋白家族提供的算法如針對(duì)抗體-抗原對(duì)接的SnugDock、同源多聚體組裝對(duì)接的SymmetricDock、多肽-蛋白對(duì)接的FlexPepDock、以及最新的Motif?Score打分函數(shù)等等。
? ? ? ?本文將簡(jiǎn)要的介紹常規(guī)的RosettaDock4.0?蛋白-蛋白復(fù)合物對(duì)接預(yù)測(cè)的基本框架和用法。

二、基本原理和算法
RosettaDock4.0的基本算法如下:?（發(fā)展過程中還有一些變種Protocol）

? ? ? ?整個(gè)對(duì)接流程分為兩個(gè)階段，在第一個(gè)低分辨率階段，蛋白質(zhì)之間的側(cè)鏈被一個(gè)粗?；蛩娲?。直接搜索蛋白質(zhì)之間的骨架形狀相適配的程度。在第二個(gè)階段才會(huì)考慮全部的側(cè)鏈，計(jì)算更加精確的相互作用能量。
? ? ? ? 起始的局部干擾，將初猜構(gòu)象的其中一個(gè)組分隨機(jī)平移和轉(zhuǎn)動(dòng)8埃和8°（或8埃，3°）。
在低精度階段，進(jìn)行500次剛性體的移動(dòng)，其中可以選擇是否進(jìn)行Ensemble的構(gòu)象交換選擇，模擬構(gòu)象選擇的過程，此階段使用的是motif_dock_score進(jìn)行打分。
在高精度階段:
? ? ? ?（1）優(yōu)化復(fù)合物側(cè)鏈構(gòu)象并能量最小化，避免側(cè)鏈packing不同對(duì)打分造成嚴(yán)重影響。
? ? ? ?（2）運(yùn)行內(nèi)部循環(huán):?運(yùn)行50次MCMCycle,?每次MCMCycle包括:?剛性體移動(dòng)、RotamerTrials優(yōu)化每一個(gè)氨基酸為最低能量狀態(tài)、并判斷能量是否大于15REU，如果能量下降太小，運(yùn)行一次剛性體之間的能量最小化。
? ? ? ?（3）?(每8步MCMCycle運(yùn)行一次full-atoms?Repack(repack模式可以分為rt_min或sc_min)
? ? ? ?（4）?外部循環(huán):?重置初始狀態(tài)，并運(yùn)行4次重復(fù)的內(nèi)部循環(huán)
? ? ? ?（5）?最后從整個(gè)mc軌跡中恢復(fù)能量最低的構(gòu)象（最后會(huì)再進(jìn)行一次能量最小化）。
如果用一張圖來生動(dòng)地說明RosettaDock是如何進(jìn)行對(duì)接的：

? ? ? ? RosettaDock對(duì)接可以理解為就是在模擬兩個(gè)分子在水溶液下隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的真實(shí)過程!?經(jīng)過足夠大的采樣，我們就可以找到兩個(gè)蛋白相互作用可能能模式。當(dāng)然這個(gè)過程中還涉及兩個(gè)基本問題:?構(gòu)象選擇(Conformation)和誘導(dǎo)契合(Induce-fit)。

2.1 構(gòu)象選擇與EnsembleDock

在RosettaDock4.0?中，啟用Ensemble模式可以有效地模擬對(duì)接時(shí)的構(gòu)象選擇。

簡(jiǎn)而言之就是通過預(yù)先生成了許多柔性的構(gòu)象，并將他們對(duì)齊到一個(gè)對(duì)接構(gòu)象上，然后進(jìn)行能量的計(jì)算，看看哪個(gè)構(gòu)象與目前的對(duì)接模式最為符合，來模擬構(gòu)象選擇的過程。
在RosettaDock4.0中，低分辨率階段使用了motif_dock_score取代了原先的interface_cen，使得near-native的構(gòu)象在低分辨率階段更加富集！

2.2?誘導(dǎo)契合
由于蛋白質(zhì)本身的柔性，兩個(gè)大分子相互作用的過程中，會(huì)發(fā)生一定的局部柔性變化，來讓二者之間結(jié)合更加穩(wěn)定。
? ? ? ?在2007年，wang?chu通過骨架原子的能量最小化可以模擬誘導(dǎo)契合的過程。但耗時(shí)增加6-7倍，并且僅限于小幅度的構(gòu)象變化。這部分方法沒有加入到標(biāo)準(zhǔn)流程中。
? ? ? ?在2008年,?Sidhartha?Chaudhury在ensemble在嘗試加入誘導(dǎo)契合相關(guān)的步驟，結(jié)果增加了復(fù)合物native-contacts的比例。這部分方法也沒有加入到標(biāo)準(zhǔn)流程中。
? ? ? ?在2011年時(shí)，SnugDock的提出更好地模擬誘導(dǎo)契合的過程，通過在對(duì)接過程中，可以對(duì)特定Loop區(qū)進(jìn)行優(yōu)化來探索稍大一些的構(gòu)象變化。

模擬這個(gè)過程可以矯正一定的模型誤差。但是RosettaDock本身并沒有直接兼容這個(gè)過程，因?yàn)樘^耗時(shí)，使用loop-refine模式比標(biāo)準(zhǔn)模式耗時(shí)增加了17-60倍。當(dāng)然對(duì)接的結(jié)果也比單獨(dú)使用EnsembleDock要好一些（針對(duì)同源模型）。

?三、RosettaDock 4.0的基本使用

3.1 前期結(jié)構(gòu)準(zhǔn)備

RosettaDock是基于MCM的對(duì)接算法，并不同于其他的剛性對(duì)接軟件，其并不擅長于全局對(duì)接，因?yàn)檎w過程的計(jì)算效率太低，因此在進(jìn)行RosettaDock之前，一般會(huì)使用ZDOCK等進(jìn)行初步地構(gòu)象摸索。選取一個(gè)或多個(gè)看起來比較合理的構(gòu)象作為出發(fā)。
可選擇的FFTs服務(wù)器:
（1）ZDOCK?server:?http://zdock.bu.edu
（2）SmoothDock?server:?http://structure.pitt.edu/servers/smoothdock
（3）ClusPro:?http://cluspro.bu.edu
（4）Haddock:?http://haddock.chem.uu.nl

有了初猜結(jié)構(gòu)complex.pdb后需要對(duì)兩個(gè)對(duì)接分子進(jìn)行預(yù)先的優(yōu)化，保證在非結(jié)合界面處的氨基酸都處于能量最低的狀態(tài)，避免他們對(duì)后續(xù)的打分排名造成干擾影響。
在Rosetta中可以使用PrePack?app來進(jìn)行。

Partners：設(shè)定對(duì)接剛性體的組成。比如我們只有兩條鏈H和A，那么就直接設(shè)定為H_A即可。如果我們有三條鏈H、L、A，其中HL鏈為二聚體，A為單體，那么此時(shí)就需要設(shè)置為LH_A。如此類推…

Example1:?標(biāo)準(zhǔn)流程
docking_prepack_protocol.macosclangrelease?-s?complex.pdb?-docking:partners?H_A?-docking::dock_rtmin?true?-ex1?-ex2aro
Example2:?EnsembleDock模式
需要提前準(zhǔn)備好ensemble1.list和ensemble2.list,?這個(gè)文件中記載了兩個(gè)對(duì)接組分的PDB文件的絕對(duì)路徑。
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0001.pdb
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0002.pdb
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0003.pdb
運(yùn)行：
docking_prepack_protocol.macosclangrelease?-s?complex.pdb?-docking:partners?H_A?-docking::dock_rtmin?true?-ex1?-ex2aro?-ensemble1?ensemble1.list?-ensemble2?ensemble2.list
一般多構(gòu)象選擇在5-10個(gè)時(shí)，運(yùn)行效率比較高。
運(yùn)行完畢后ensemble.list的格式會(huì)發(fā)生改變：
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0001.pdb.ppk
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0002.pdb.ppk
input_files/COL_D_ensemble/COL_D_0003.pdb.ppk
0.77058
0
1.00377
-93.3588
-94.2715
-93.9065

3.2 運(yùn)行RosettaDock 4.0

運(yùn)行RosettaDock非常方便，一條命令就完全足夠了。

注:?motif_dock_score?bin文件需要輸入絕對(duì)路徑,?需要根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。并且motif_dock_score十分吃內(nèi)存，一個(gè)進(jìn)程大概3GB左右。注意控制并行進(jìn)程數(shù)量，不要超出上限導(dǎo)致崩潰。如果不想使用motif_dock_score,?只要將與mh相關(guān)以及-docking_low_res_score?motif_dock_score的flag刪除即可。

motifdock_score?bin的絕對(duì)路徑例子:?`/usr/local/rosetta_src_2019.21.60746_bundle/main/database/additional_protocol_data/motif_dock/xh_16`
Example1:?運(yùn)行l(wèi)ocal_dock標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算流程
docking_protocol.linuxgccrelease?-s?prepacked.pdb?-partners?H_A?-dock_pert?3?8?-ex1?-ex2aro?-spin?-use_input_sc?-dock_mcm_trans_magnitude?0.7?-dock_mcm_rot_magnitude?5.0?-nstruct?1000?-mh:path:scores_BB_BB?[path?to?score?tables?+?score?table?prefix]?-mh:score:use_ss1?false?-mh:score:use_ss2?false?-mh:score:use_aa1?true?-mh:score:use_aa2?true?-docking_low_res_score?motif_dock_score

Example2:?運(yùn)行EnsembleDock:

docking_protocol.linuxgccrelease?-s?prepacked.pdb?-partners?H_A?-dock_pert?3?8?-ex1?-ex2aro?-spin?-use_input_sc?-dock_mcm_trans_magnitude?0.7?-dock_mcm_rot_magnitude?5.0?-nstruct?1000?-ensemble1?ensemble1.list?-ensemble2?ensemble2.list?-mh:path:scores_BB_BB?[path?to?score?tables?+?score?table?prefix]?-mh:score:use_ss1?false?-mh:score:use_ss2?false?-mh:score:use_aa1?true?-mh:score:use_aa2?true?-docking_low_res_score?motif_dock_score

注1:?采樣1000~5000個(gè)構(gòu)象就比較充分了。
注2:?如果不想局部探索構(gòu)象變化過大偏離（比如不想讓一個(gè)分子的狀態(tài)掉了個(gè)頭或完全翻轉(zhuǎn)時(shí)），可以取消-spin選項(xiàng)，那么分子的朝向變化就會(huì)比較小。

3.3 局部構(gòu)象優(yōu)化

有時(shí)候，我們得到的最終構(gòu)象變化過大可能由于一些小的骨架沖突導(dǎo)致復(fù)合物整體能量較高，那么此時(shí)我么就可以采取沒那么激進(jìn)的采樣策略。

Example:?local_refinement
docking_protocol.linuxgccrelease?-s?prepacked.pdb?-partners?H_A?-dock_pert?3?8?-ex1?-ex2aro?-use_input_sc?-dock_mcm_trans_magnitude?0.1?-dock_mcm_rot_magnitude?3.0?-nstruct?100?-docking_local_refine
如果想讓蛋白復(fù)合物構(gòu)象更合理一些，可以使用FastRelax對(duì)復(fù)合物進(jìn)行放松。

四、結(jié)果分析
4.1?能量和界面參數(shù)分析
蛋白-蛋白對(duì)接的分析官方教程是推薦使用total_score和I_sc兩項(xiàng)。對(duì)于初步分析來說已經(jīng)完全足夠了。如果還想做更加深入的分析，可以使用Rosetta?InterfaceAnalyzer?app來進(jìn)行復(fù)合物界面分析。
我們可以得到更多的數(shù)據(jù)，比如包埋表面積(dSASA_int)、形狀互補(bǔ)度(shape_complementarity)、氨基酸堆積緊密度(packstat)、未飽和成鍵的極性原子數(shù)量(delta_unsatHbonds)、氫鍵數(shù)量和氫鍵能量等等…

可以經(jīng)過一些經(jīng)驗(yàn)參數(shù)對(duì)構(gòu)象進(jìn)一步地過濾,比如：
（1）蛋白-蛋白復(fù)合物包埋表面積在1100~1600?^2。
（2）蛋白-蛋白復(fù)合物形狀互補(bǔ)度大致在0.6-0.8之間，說明模型結(jié)果更佳
（3）氨基酸堆積緊密度(packstat)在0.65以上，那么模型較優(yōu)
（4）未飽和成鍵的極性原子數(shù)量(delta_unsatHbonds)數(shù)量越少，說明界面極性和非極性局部區(qū)域匹配地更好
4.2?初猜構(gòu)象的影響
除此以外，蛋白-蛋白對(duì)接精度和可信度還和初始構(gòu)象等有比較大的關(guān)系。如果一開始的初猜構(gòu)象和真實(shí)相差較遠(yuǎn)，那么優(yōu)化出來的構(gòu)象也會(huì)偏離較遠(yuǎn)。
比如不同的剛性對(duì)接軟件，給出的模型質(zhì)量是不一樣的。

根據(jù)2015年的一篇跑分文章，可見使用ZDOCK3.0.2提供的初始構(gòu)象質(zhì)量可能越好。當(dāng)然也可以使用多種軟件一起預(yù)測(cè)，選取更多的初始構(gòu)象。

4.3?復(fù)合物的類型
不同復(fù)合物類型的對(duì)接精度也有所不同。
根據(jù)Docking?Benchmark?Version?5的組成分類：
（1）酶相關(guān)
（2）抗體-抗原復(fù)合物
（3）其他(others)
根據(jù)對(duì)接難度等級(jí)分為：
（1）Rigid?body
（2）Medium
（3）Difficult
RosettaDock3.2的跑分結(jié)果：

如果你的復(fù)合物類型是酶-抑制物或抗體-抗原復(fù)合物類型時(shí)，成功率會(huì)稍高一些，如果復(fù)合物類型屬于其他分類，那么精度就有所下降了。但并非絕對(duì)，還要看是否屬于Rigid?body下的分類。

5?如何更好地提升模型的精度？
目前整體的發(fā)展趨勢(shì)趨向于基于實(shí)驗(yàn)低精度信息整合的蛋白-蛋白對(duì)接。如ZDOCK最近發(fā)展出ZDOCK_XL基于交聯(lián)質(zhì)譜信息的剛性對(duì)接、ClusPro基于SAXS小角衍射數(shù)據(jù)的對(duì)接、還有HADDOCK基于NMR數(shù)據(jù)的限制來進(jìn)行對(duì)接，可謂百花齊放，其中以HADDOCK為首。

在RosettaDock中，我們可以利用限制參數(shù)來影響對(duì)接的過程，以下是一些可用實(shí)驗(yàn)信息整合對(duì)接的策略：
（1）利用實(shí)驗(yàn)點(diǎn)突變信息，發(fā)現(xiàn)基本的結(jié)合區(qū)域，并限制熱點(diǎn)殘基之間的距離
（2）如果有同源蛋白的復(fù)合物，我們也可以直接將對(duì)接組分直接對(duì)齊到同源蛋白上作為初猜構(gòu)象(很大幫助)
（3）隨著質(zhì)譜交聯(lián)技術(shù)成本的降低，可以獲取到復(fù)合物界面氨基酸的相互作用對(duì)的信息，幫助生成初猜構(gòu)象和生成距離限制。
（4）根據(jù)文獻(xiàn)，封鎖掉非活性相關(guān)的區(qū)域。

最后可以采取計(jì)算量更大一些的分子動(dòng)力學(xué)對(duì)復(fù)合物構(gòu)象的穩(wěn)定性進(jìn)行模擬，如果是一些不合理的構(gòu)象，我們可以從動(dòng)力學(xué)的軌跡中觀察到兩個(gè)對(duì)接組分的快速解離。