一.文章基本信息

文章來源：鄭艷玲, 姜八一, 張涌. DMEM與Ham's F-10培養(yǎng)基對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化影響比較研究[J]. 中國畜禽種業(yè), 2022, 18(5): 26-29.
基金項目：轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項（2008ZX080072004）；山東省農(nóng)業(yè)良種工程項目（南種北繁），項目編號：2017LZN022。
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二.文章全文

摘 要：?本研究旨在比較DMEM 與Ham's F-10 兩種培養(yǎng)基對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞體外培養(yǎng)過程中增殖與分化的影響。采用膠原酶和胰酶聯(lián)用的方法分離骨骼肌衛(wèi)星細胞后平均分為兩組，分別采用DMEM 和Ham's F-10 培養(yǎng)基對兩組細胞進行培養(yǎng)，采用RT-PCR 和免疫熒光方法對細胞進行鑒定，并觀察比較兩種培養(yǎng)基對牛骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化的影響。結(jié)論：本實驗采用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)7d 后的牛骨骼肌衛(wèi)星細胞不經(jīng)過誘導(dǎo)分化能自行發(fā)生分化成肌管，而用Ham's F-10 培養(yǎng)基培養(yǎng)7d 后的牛骨骼肌衛(wèi)星細胞90%以上處于增殖狀態(tài)，僅有少量細胞發(fā)生分化融合成肌管。本研究結(jié)果表明，Ham's F-10 比DMEM 更有利于牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖，抑制其分化。

關(guān)鍵詞：?牛；骨骼肌衛(wèi)星細胞；DMEM；Ham's F-10；增值；分化

?

骨骼肌衛(wèi)星細胞(skeletal satellite cells) 是一類位于骨骼肌肌膜(sacrolenuna) 與基底膜(haaslelmin) 之間的成體干細胞?[1]，因其位置與排列類似肌細胞的衛(wèi)星，因此被稱為衛(wèi)星細胞。1961 年，Muaor 首次從青蛙骨骼肌纖維中發(fā)現(xiàn)骨骼肌衛(wèi)星細胞，這些細胞在骨骼肌生長發(fā)育和再生過程中發(fā)揮著非常重要作用?[2]。一般情況下，這些細胞處于靜止?fàn)顟B(tài)，而當(dāng)肌細胞受到損傷刺激時，骨骼肌衛(wèi)星細胞即被激活、增殖并與原有的骨骼肌細胞相互融合，形成新的肌纖維細胞?[3]，1974 年，Bischoff從大鼠骨骼肌中分離出骨骼肌衛(wèi)星細胞，并對其進行了體外培養(yǎng)，隨后很多種動物的骨骼肌衛(wèi)星細胞被成功分離及培養(yǎng)?[4-10]。

體外培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞可應(yīng)用于組織工程、基因治療及基因功能研究等多個方面，因此，有必要建立理想的骨骼肌衛(wèi)星細胞的獲取、培養(yǎng)與純化的方法，為利用骨骼肌衛(wèi)星細胞研究基因功能打下基礎(chǔ)。以目前的實驗方法所獲得的骨骼肌衛(wèi)星細胞中不可避免會混有成纖維細胞，因此，獲得高純度的骨骼肌衛(wèi)星細胞一直是研究者不斷追求的目標(biāo)。本研究采用混合酶消化法分離得到了大量優(yōu)質(zhì)牛骨骼肌衛(wèi)星細胞，采用DMEM和Ham’?s F-10 兩種培養(yǎng)基對分離的骨骼肌衛(wèi)星細胞進行培養(yǎng)比較研究，為獲得高純度牛骨骼肌衛(wèi)星細胞，并使其處于增殖狀態(tài)培養(yǎng)基的選擇提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗材料

牛胎兒取自西安屠宰場。置于4℃PBS 保存液中，在12 h內(nèi)帶回實驗室。保存液為PBS+200 IU/ml 青霉素+200 IU/ml鏈霉素。

2 實驗方法

2.1 骨骼肌衛(wèi)星細胞的分離和培養(yǎng)

從西安屠宰場取60d 左右的牛胎兒，取其后肢肌肉組織，用含青鏈霉素的PBS 溶液將肌肉塊沖洗干凈，在無菌條件下剔除血管、結(jié)締組織，將肌肉組織剪成盡量小的組織塊，將剪碎的組織放入5ml?離心管中，加入1 倍體積的混合酶消化液（dispase II 2.4U/ml，collagenase 1%，CaCl2 2.5mmol/L)，37℃消化45min，其每間隔15min 用吸管吹打5min，重復(fù)3 次，然后加入兩倍體積含20% FBS 的培養(yǎng)液中中止消化，反復(fù)吹打后濾過200 目的篩網(wǎng)，收集濾液，500g/min 離心7min，棄上清液，分兩組分別用含15%胎牛血清的Ham’?s F-10 及DMEM 生長培養(yǎng)基重懸細胞。

2.2 骨骼肌衛(wèi)星細胞的純化

將裝有重懸骨骼肌衛(wèi)星細胞的培養(yǎng)皿置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0.5h，進行第一次貼壁，記為P1。0.5h 后，吸取培養(yǎng)皿上清液置入新的培養(yǎng)皿中，混勻，進行第2 次貼壁，記為P2。24h 后取P2 上清液，1000r/min 離心5min，棄上清，細胞沉淀用生長培養(yǎng)基重懸，移入新的培養(yǎng)皿中，進行第3 次貼壁，記為P3。棄去P1、P2，將培養(yǎng)有P3 細胞的培養(yǎng)皿中的細胞每隔2d 更換新的生長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，相差顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)及增殖狀況。

2.3 骨骼肌衛(wèi)星細胞生長曲線的確定

用四甲基偶氮唑鹽實驗（MTT）比色法測定細胞生長曲線。

2.4 骨骼肌衛(wèi)星細胞RT-PCR 擴增鑒定

采用Trizol 試劑(Invitrogen) 提取貼壁生長48h 的衛(wèi)星細胞總RNA，按照PrimeScript??RT reagent Kit (Perfect Real Time) 說明書合成cDNA 第一鏈，以cDNA 為模板對牛生肌調(diào)節(jié)基因MyoD、Myf5、Myogenin、MRF4 及β-actin 基因進行RT-PCR 擴增。引物序列如表1。

表1 RT-PCR 引物序列

2.5 骨骼肌衛(wèi)星細胞的免疫熒光鑒定

取原代分離后傳至第2?代的細胞，在DMEM培養(yǎng)基及Ham's F-10 培養(yǎng)基中均培養(yǎng)24h 及7d 后，采用免疫熒光方法鑒定骨骼肌衛(wèi)星細胞的肌源性標(biāo)志中間絲蛋白desmin 的表達，同時用hochest 對細胞核進行染色，在熒光顯微鏡下觀察實驗結(jié)果。以本實驗室保存的成纖維細胞作為陰性對照。

3 結(jié)果

3.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞的獲得與細胞生長曲線的測定

3.1.1 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

經(jīng)酶消化后獲得的骨骼肌衛(wèi)星細胞為球形，將其接種在鋪有多聚賴氨酸的細胞培養(yǎng)皿中，進行差速貼壁純化后獲得的骨骼肌衛(wèi)星細胞在接種24h 后細胞開始貼壁，培養(yǎng)2d 后細胞貼壁完全并開始增殖。貼壁后絕大多數(shù)細胞為紡錘形或梭形，細胞體積比成纖維細胞要小，但核質(zhì)比比較大，有兩極性，胞核折光性較強。少數(shù)細胞呈現(xiàn)多角形的形狀，有細胞突起，肌細胞之間會相互聯(lián)結(jié)成網(wǎng)狀（如圖1 所示）。隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸呈現(xiàn)有規(guī)律性的平行方向排列生長狀態(tài)。

圖1 貼壁生長2d 骨骼肌衛(wèi)星細胞(×200）

3.1.2 采用MTT 法測定骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖狀態(tài)

實驗結(jié)果顯示，接種24h 后細胞開始增殖，2d 后增殖旺盛，3d?后細胞增殖速度達到高峰，4d 后細胞逐漸停止增殖，其中Ham's F-10 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞比DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞增殖活力要高一些，結(jié)果如圖2。

圖2 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的骨骼肌衛(wèi)星細胞生長曲線

3.2 骨骼肌衛(wèi)星細胞RT-PCR?擴增鑒定結(jié)果

分離的骨骼肌衛(wèi)星細胞在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)2d，細胞處于增殖旺盛期，因此，進行RT-PCR 實驗時能擴增出增殖期骨骼肌衛(wèi)星細胞的標(biāo)記基因MyoD 和Myf5，而分化期標(biāo)記基因myogenin 和MRF4 也有表達，但表達量很少，說明分離的細胞為骨骼肌衛(wèi)星細胞，結(jié)果如圖3。

圖3 骨骼肌衛(wèi)星細胞標(biāo)記基因RT-PCR 擴增結(jié)果
M：50 bp DNA Ladder；1：MyoD；2：Myf5；3：myogenin；4：MRF4

3.3 免疫熒光檢測結(jié)果

熒光顯微鏡下觀察結(jié)果顯示，對照組成纖維細胞desmin 免疫熒光檢測不發(fā)光，為陰性，如圖4A；骨骼肌衛(wèi)星細胞desmin 免疫熒光檢測發(fā)紅色熒光，為陽性，如圖4B；分離的細胞在Ham's F-10 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d 后，細胞仍然處于增殖狀態(tài)，培養(yǎng)4d 后細胞增殖變慢，培養(yǎng)7d 后骨骼肌衛(wèi)星細胞的純度達99%以上，接近100%，少量骨骼肌衛(wèi)星細胞分化融合為肌管，細胞desmin 免疫熒光檢測均發(fā)紅色熒光，基本沒有成纖維細胞存在，如圖4C，說明，Ham's F-10 培養(yǎng)基對成纖維細胞的增殖有抑制作用；分離的細胞在DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)3d后，細胞達到80%以上的匯合度，骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖速度減慢，細胞進入分化階段，細胞相互靠攏、融合，培養(yǎng)7d 后細胞完全融合成較粗的肌管，desmin 免疫熒光檢測發(fā)紅色熒光，肌管之間混雜有很多不發(fā)紅色熒光的成纖維細胞，如圖4D。

圖4 牛骨骼肌衛(wèi)星細胞免疫熒光檢測結(jié)果（×200，標(biāo)尺代表50μm）
（A1，B1，C1，D1）為細胞在自然光下觀察的結(jié)果
（A2，B2，C2，D2）為Hoechst333258 核染色結(jié)果
（A3，B3，C3，D3）為desmin 染色結(jié)果
（A4，B4，C4，D4）為細胞核染色和desmin 染色的復(fù)合圖

4 討論

20 世紀(jì)70 年代，Richler 等建立起了分離和體外培養(yǎng)原代衛(wèi)星細胞的實驗技術(shù)。分離方法主要有組織塊法、酶消化分離法等，而酶消化分離法主要有膠原酶、胰蛋白酶、鏈酶蛋白酶、中性蛋白酶及2 或3 種酶并用法等。在這些酶消化法中，研究者多采用膠原酶和胰酶分步消化或混合酶聯(lián)合消化的方法進行衛(wèi)星細胞的分離。采用膠原酶和胰蛋白酶分步消化法需要酶消化時間比較長，一般需要50～70min。本實驗也采用了膠原酶和胰蛋白酶組成的混合酶對牛胎兒骨骼肌衛(wèi)星細胞進行消化分離，在消化過程中，膠原酶使肌束肌纖維相互分離，而分散酶使肌衛(wèi)星細胞從肌纖維上分離下來，實驗時用混合酶僅需45min 即可使肌纖維相互分離并將骨骼肌衛(wèi)星細胞從肌纖維上消化下來，大大節(jié)省了實驗操作時間，同時消化時間的縮短可減少酶消化對細胞造成的損傷。

為了確定消化下來的細胞是否為骨骼肌衛(wèi)星細胞，需要對獲得的細胞進行鑒定。結(jié)蛋白(desmin) 是較早表達的肌源性標(biāo)志蛋白之一，它是肌細胞內(nèi)細胞骨架中間絲的構(gòu)成成分，體外培養(yǎng)形態(tài)類似于衛(wèi)星細胞的成纖維細胞不表達這種蛋白，因此，結(jié)蛋白是鑒定肌衛(wèi)星細胞的標(biāo)志蛋白之一?[11-12]。消化下來的骨骼肌衛(wèi)星細胞中摻雜有大量的成纖維細胞，如何從中純化骨骼肌衛(wèi)星細胞是骨骼肌衛(wèi)星細胞分離的熱點。利用免疫磁珠分選技術(shù)、流式細胞分選技術(shù)和平面黏附分離法等技術(shù)可獲得高純度的骨骼肌衛(wèi)星細胞，但由于很多部門都缺乏相應(yīng)的實驗設(shè)備，并且實驗所需抗體等試劑價格非常昂貴，使這種方法的廣泛應(yīng)用受限?[13]。在大多數(shù)實驗室，人們通常采用差速貼壁的方法純化骨骼肌衛(wèi)星細胞，但這種方法也無法獲得高純度的骨骼肌衛(wèi)星細胞。人們在培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞時所用的培養(yǎng)基主要是DMEM 培養(yǎng)基，在這種培養(yǎng)基中，隨著培養(yǎng)時間的延長往往形成成纖維細胞的生長優(yōu)勢。而Thomas A.Rando 等對小鼠骨骼肌細胞進行分離時采用Ham's F-10 培養(yǎng)基對骨骼肌衛(wèi)星細胞進行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在Ham's F-10 培養(yǎng)基中骨骼肌衛(wèi)星細胞比成纖維細胞優(yōu)先生長，隨著培養(yǎng)時間的延長，骨骼肌衛(wèi)星細胞不斷得到富集。L.Zhang 等利用Ham's F-10 培養(yǎng)基對綿羊骨骼肌成肌細胞進行培養(yǎng)，得出隨著培養(yǎng)時間的延長，Ham's F-10 培養(yǎng)基也能使綿羊骨骼肌成肌細胞富集的結(jié)論?[14]。本實驗利用混合酶對胎牛骨骼肌進行消化，用DMEM 及Ham's F-10 分別對消化下來的混有成纖維細胞的骨骼肌衛(wèi)星細胞進行純化，然后用DMEM 及Ham's F-10 對純化的骨骼肌衛(wèi)星細胞進行培養(yǎng)，比較了兩種培養(yǎng)基對骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖和分化的影響，結(jié)果顯示，用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)骨骼肌衛(wèi)星細胞時，培養(yǎng)2d 肌細胞會相互融合，7d 后完全融合形成較粗的肌管，而利用Ham's F-10 培養(yǎng)基對骨骼肌成肌細胞進行培養(yǎng)時，骨骼肌衛(wèi)星細胞90%以上的細胞處于增殖狀態(tài)，只有很少數(shù)處于分化狀態(tài)，并相互融合形成較細的肌管，同時，Ham's F-10 培養(yǎng)基能抑制成纖維細胞的增殖，因此，隨著培養(yǎng)時間的延長，骨骼肌衛(wèi)星細胞得到純化，這樣非常有利于在基因工程實驗中對在骨骼肌衛(wèi)星細胞進行轉(zhuǎn)基因表達研究。Ham's F-10 培養(yǎng)基對成纖維細胞增殖的抑制作用機理及對骨骼肌衛(wèi)星細胞分化融合的抑制作用機理還有待于進一步研究。

5 結(jié)論

本實驗利用混合酶消化法及差速貼壁法分離培養(yǎng)得到高純度牛骨骼肌衛(wèi)星細胞。分離得到的骨骼肌衛(wèi)星細胞在含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中不需要分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)，骨骼肌衛(wèi)星細胞就可進行分化融合成肌管；在含15%胎牛血清的Ham's F-10 培養(yǎng)基中，骨骼肌衛(wèi)星細胞90%以上的可不斷進行增殖而不發(fā)生分化融合，同時，Ham's F-10 培養(yǎng)基可抑制成纖維細胞的增殖，因此，隨著培養(yǎng)時間的延長，用Ham's F-10 培養(yǎng)基可進一步對骨骼肌衛(wèi)星細胞進行純化。

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來源：“中國畜禽種業(yè)”公眾號,作者~。
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