肝內膽管癌（iCCA）是第二常見的原發(fā)性肝癌，全球發(fā)病率逐年上升。目前，手術是iCCA最有效的治療方法，但術后5年生存率低且復發(fā)率高。此外，對于不可手術切除的iCCA患者，放化療效果較差；而且，對于可手術切除的iCCA患者，放化療效果短暫[1,2]。因此，我們迫切需要提高對iCCA進展和轉移機制的認識，開發(fā)更先進的診斷技術和新的治療靶點，以提高iCCA患者的生存率。

環(huán)狀RNA（circRNA）因其共價閉合的環(huán)狀結構特點而具有穩(wěn)定性，成為了新型的生物標志物。circRNA具有miRNA和蛋白海綿功能，調控下游相關蛋白的表達，使癌癥發(fā)生相關的信號通路激活或失活。然而，circRNA在iCCA轉移中的潛在機制仍有待進一步闡明。

2023年5月18日，四川大學華西醫(yī)院肝臟外科研究室袁克非和曾勇團隊在Journal of Experimental&Clinical Cancer Research?發(fā)表文章CircZNF215 promotes tumor growth?and?metastasis through?inactivation?of?the?PTEN/AKT pathway in?intrahepatic?cholangiocarcinoma。作者在肝內膽管癌細胞中鑒定到一個新的環(huán)狀RNA——cZNF215。cZNF215在術后轉移的iCCA組織中的表達水平明顯上調，并且與iCCA轉移和iCCA患者預后不良相關。在體內外過表達cZNF215均能促進了iCCA細胞的生長和轉移，而敲低cZNF215具有相反的作用。cZNF215與PRDX1競爭性相互作用，阻斷了PRDX1和PTEN之間的關聯(lián)，導致PTEN/AKT途徑失活，最終促進了iCCA的發(fā)生和轉移。文章解析了cZNF215介導PTEN/AKT途徑促進iCCA生長和轉移機制，揭示cZNF215可作為潛在的iCCA治療靶點。

cZNF215在iCCA組織中高表達，并與iCCA患者預后不良相關

首先，作者通過circRNA-seq分析了術后未發(fā)生轉移和已發(fā)生轉移的iCCA組織中circRNA表達譜的差異，再用qRT-PCR方法在iCCA細胞系進行檢測，發(fā)現(xiàn)有4個circRNA的表達水平顯著上調。其中，cZNF215在iCCA細胞系中的過表達水平最顯著，值得進一步研究。經過RNase R耐受性測試和FISH實驗分析，鑒定了cZNF215環(huán)狀結構的穩(wěn)定性及其在胞漿中的定位。在有或無轉移的iCCA組織以及鄰近的正常組織進行qRT-PCR檢測cZNF215的表達水平，發(fā)現(xiàn)其在iCCA組織中的表達與正常組織相比顯著上調，并且在有轉移iCCA組織中的表達水平與無轉移的iCCA組別相比顯著上調，表明cZNF215可能與iCCA患者的預后不良和癌細胞轉移相關。而且，通過Kaplan-Meier曲線分析發(fā)現(xiàn)，cZNF215高表達組的iCCA患者的總生存期和無復發(fā)生存期較短。

cZNF215在體內外均促進iCCA的生長和轉移

作者運用siRNA和構建慢病毒過表達載體對cZNF215進行敲低或過表達，檢測其細胞功能。發(fā)現(xiàn)敲低cZNF215顯著抑制RBE和HuCCT1細胞增殖、侵襲和轉移，而過表達cZNF215后觀察到相反的結果。為了進一步探索cZNF215在體內的生物學功能，作者分別通過shRNA載體和慢病毒過表達載體構建穩(wěn)轉株細胞，并應用到小鼠腫瘤模型中，用螢火蟲熒光素酶標記并通過體內成像系統(tǒng)（IVIS）進行追蹤，發(fā)現(xiàn)cZNF215的過表達顯著促進腫瘤生長和轉移，而cZNF215的敲低則抑制了iCCA生長和轉移。綜上表明，cZNF215在體外和體內均促進了iCCA的生長和轉移。

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cZNF215通過促進PTEN氧化使PTEN/AKT途徑失活

作者采用RNAseq方法研究了cZNF215過表達調控的潛在基因，推測cZNF215可能通過氧化誘導的PTEN/AKT通路失活來促進iCCA的生長和轉移。WB實驗結果表明，cZNF215過表達確實增強了PTEN氧化和AKT（Ser473和Thr308）磷酸化，而敲低cZNF215則降低了PTEN氧化水平和AKT磷酸化水平。此外，在iCCA組織中進行IHC染色發(fā)現(xiàn)，cZNF215高表達組比cZNF215低表達組的AKT磷酸化水平更強。作者進一步探索PTEN在PTEN/AKT途徑的介導作用，WB結果顯示，過表達PTEN使AKT Ser473/Thr308磷酸化水平顯著降低，而敲低PTEN則提高了AKT Ser473/Thr308磷酸化水平。接著，作者通過一系列細胞功能實驗發(fā)現(xiàn)，NAC（一種調節(jié)細胞內氧化還原狀態(tài)的含巰基抗氧化劑）可以逆轉由cZNF215過表達引起的iCCA細胞增殖、遷移和侵襲，而PTEN失活則使cZNF215敲低后仍發(fā)生iCCA細胞增殖，遷移和侵襲的情況。總之，以上數(shù)據(jù)表明，過表達cZNF215使氧化誘導的PTEN/AKT途徑失活，從而促進了iCCA的生長和轉移。

cZNF215與PRDX1互作使PTEN/AKT途徑失活

作者通過RNA pull-down實驗和質譜檢測，發(fā)現(xiàn)PRDX1是cZNF215最可能的RBP，并用RIP實驗確認了cZNF215和PRDX1在iCCA細胞中的互作。為了進一步探索PRDX1在iCCA腫瘤發(fā)生中的作用，作者敲低或過表達PRDX1后檢測PTEN氧化水平和AKT磷酸化水平，WB結果顯示，PRDX1的過表達顯著降低了PTENox和AKT磷酸化水平，而敲低PRDX1則出現(xiàn)相反的結果。此外，過表達PRDX1減弱了cZNF215過表達對AKT磷酸化的促進作用，而敲低PRDX1挽救了cZNF215誘導的AKT磷酸化的減少。在功能上，過表達PRDX1顯著減弱了cZNF215過表達而引起的細胞增殖、遷移和侵襲，而敲低PRDX1則消除了cZNF215敲低對細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用。綜上表明，cZNF215通過與PRDX1相互作用促進氧化誘導的PTEN失活，從而促進了iCCA的腫瘤進展和轉移。

cZNF215阻止PRDX1和PTEN互作來促進PTEN氧化

作者通過RNA pull-down和RIP實驗發(fā)現(xiàn)，PRDX1的N端結構域（NTD，1-40 aa）和PRDX1的C端結構域（CTD，157-199 aa）對其與cZNF215的相互作用十分關鍵。而且，Co-IP實驗結果也表明，PTEN主要與PRDX1的NTD和CTD結合。而且過表達cZNF215顯著削弱了PRDX1-PTEN的相互作用，而敲低cZNF215則增強了PRDX1和PTEN之間的相互作用，PLA測定結果進一步證實該結果。此外，作者通過cZNF215 pull-down實驗發(fā)現(xiàn)，敲低PTEN使cZNF215富集了更多PRDX1，進一步表明cZNF215和PTEN與PRDX1的競爭性相互作用。綜上表明，cZNF215通過與PRDX1競爭性結合來阻斷PRDX1和PTEN之間的互作，從而導致氧化誘導的PTEN失活和AKT磷酸化，最終促進iCCA的進展和轉移。

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敲低cZNF215可增強ipatasertib在體內的抗腫瘤作用

作者通過裸鼠皮下移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)，單獨敲低cZNF215或使用ipatasertib可顯著抑制腫瘤生長，并且結合cZNF215敲低與ipatasertib治療能進一步增強對腫瘤生長的抑制作用。而且，在肝原位移植瘤模型和肺轉移癌模型中均得到了相似的實驗結果。此外，與單獨使用ipatasertib治療相比，敲低cZNF215顯著增強了ipatasertib介導的iCCA抑制作用。總而言之，靶向敲低cZNF215以增強ipatasertib的抗腫瘤作用，可能是iCCA的潛在治療策略。

總結

cZNF215與PRDX1（NTD和CTD區(qū)域）競爭性結合，促進PRDX1與PTEN的解離，使PTEN被氧化誘導，導致PTEN/AKT通路失活，促進iCCA的生長和轉移。

參考文獻：

[1] Sumiyoshi T, Shima Y, Okabayashi T, et al. Chemoradiotherapy for Initially Unresectable Locally Advanced Cholangiocarcinoma. World J Surg. 2018; 42(9): 2910-8.

[2] Cidon EU. Resectable Cholangiocarcinoma: Reviewing the Role of Adjuvant Strategies. Clin Med Insights Oncol. 2016; 12(10): 43-8.

原文鏈接：

https://doi.org/10.1186/s13046-023-02699-w