轉(zhuǎn)染是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中廣泛使用的技術(shù)，通過(guò)轉(zhuǎn)染可將外源核酸（DNA、RNA等）引入真核細(xì)胞，從而對(duì)基因的產(chǎn)物或其功能進(jìn)行研究，是基因編輯細(xì)胞構(gòu)建必不可少的步驟。然而轉(zhuǎn)染效率不高的問(wèn)題，總是困擾著許多新手小白，時(shí)常也會(huì)令頗有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞培養(yǎng)達(dá)人感到頭禿。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染的效率跟哪些因素有關(guān)呢？總的來(lái)說(shuō)可以概括為三個(gè)方面：

1) 細(xì)胞本身：包括細(xì)胞的種類、來(lái)源和代次等，這些信息基本決定了該細(xì)胞是否容易被轉(zhuǎn)染。

2) 轉(zhuǎn)染載體：轉(zhuǎn)染載體的大小、質(zhì)量和用量也對(duì)轉(zhuǎn)染效率有影響，對(duì)于不同大小的載體需要優(yōu)化不同的實(shí)驗(yàn)參數(shù)或用量，在質(zhì)量方面需要對(duì)質(zhì)粒的濃度、純度和構(gòu)象、RNA是否降解等進(jìn)行嚴(yán)格的把控。

3) 轉(zhuǎn)染方法和試劑：沒(méi)有一種轉(zhuǎn)染方法適用所有細(xì)胞，對(duì)于不同的細(xì)胞，選擇合適的轉(zhuǎn)染方法和試劑至關(guān)重要。

其中細(xì)胞和載體大家相對(duì)來(lái)說(shuō)比較熟悉，今天小源主要從第3點(diǎn)轉(zhuǎn)染方法和試劑著手，給大家進(jìn)行總結(jié)和分享。

首先，我們來(lái)盤點(diǎn)一下細(xì)胞轉(zhuǎn)染都有哪些方法？按照轉(zhuǎn)染的原理，大致可分為物理介導(dǎo)（如電穿孔法、顯微注射法、基因槍法）、化學(xué)介導(dǎo)（如磷酸鈣共沉淀法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法、陽(yáng)離子聚合物介導(dǎo)法等）和生物介導(dǎo)（主要是各種病毒）三類。其中實(shí)驗(yàn)室最常用的主要有物理介導(dǎo)的電穿孔法、化學(xué)介導(dǎo)的脂質(zhì)體法和生物介導(dǎo)的慢病毒法。

脂質(zhì)體法：

脂質(zhì)體通過(guò)表面的正電荷與核酸磷酸基團(tuán)的負(fù)電荷相互作用形成內(nèi)包DNA分子的復(fù)合物，復(fù)合物表面帶正電，會(huì)被帶負(fù)電的細(xì)胞膜所吸附，進(jìn)而通過(guò)融合或細(xì)胞內(nèi)吞完成外源DNA分子的導(dǎo)入，是目前實(shí)驗(yàn)室最方便的轉(zhuǎn)染方式之一。

具體過(guò)程分為幾步：

1) 轉(zhuǎn)染試劑與核酸在體外孵育時(shí)形成帶正電荷的復(fù)合物。

2) 復(fù)合物被添加到細(xì)胞中，通過(guò)靜電相互作用與帶負(fù)電的細(xì)胞表面結(jié)合。

3) 細(xì)胞通過(guò)內(nèi)吞作用將復(fù)合物內(nèi)化到稱為內(nèi)體的膜囊泡中。

4) 轉(zhuǎn)染試劑使內(nèi)體膜不穩(wěn)定。

5) 復(fù)合物從內(nèi)體中逸出并在細(xì)胞質(zhì)中釋放核酸（siRNA、miRNA 或大RNA通常在細(xì)胞質(zhì)中具有活性）。

6) DNA 必須定位于基因表達(dá)盒轉(zhuǎn)錄的細(xì)胞核。

電穿孔轉(zhuǎn)染法：

電穿孔法通過(guò)高強(qiáng)度電場(chǎng)引起細(xì)胞膜電位變化，瞬時(shí)提高細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞膜上產(chǎn)生可逆性小孔便于外源核酸的進(jìn)入（圖2），適用于幾乎所有類型的細(xì)胞，是目前一種較為強(qiáng)大的轉(zhuǎn)染方式。目前市面上比較常用的電轉(zhuǎn)儀品牌有Thermo的Neon、Lonza的Nucleofector系列、Bio-rad電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，還有后起之秀Celetrix等。

慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)法：

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂細(xì)胞和分裂細(xì)胞。人類免疫缺陷病毒1型 (HIV-1) 是研究得最多的慢病毒。具體過(guò)程為：

1）通過(guò)將基因工程改造的目的質(zhì)粒與病毒包裝所需的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)到293T工具細(xì)胞，生產(chǎn)細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的慢病毒顆粒。

2）將慢病毒顆粒轉(zhuǎn)染靶細(xì)胞，慢病毒表面包膜蛋白與細(xì)胞受體結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞。

3）慢病毒RNA被逆轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA。

4）雙鏈DNA與整合酶形成預(yù)整合復(fù)合物，再通過(guò)核孔復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)。

5）整合酶將慢病毒LTR之間的部分整合到細(xì)胞基因組上。

6）整合的外源DNA開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，表達(dá)目的基因。

了解了三種轉(zhuǎn)染方法的基本原理，接下來(lái)小源還幫大家歸納了它們各自的優(yōu)缺點(diǎn)。

那么問(wèn)題來(lái)了，如果你剛拿到一種新的細(xì)胞，怎么確定使用哪種轉(zhuǎn)染方法呢？

1.了解細(xì)胞：首先，要從細(xì)胞供應(yīng)商或網(wǎng)上查詢細(xì)胞背景，了解細(xì)胞的來(lái)源、特性、培養(yǎng)條件、代次和增殖時(shí)間等信息，對(duì)細(xì)胞有個(gè)初步的了解。

2.參考轉(zhuǎn)染案例：找到成功的轉(zhuǎn)染案例做參考可以讓你少走彎路！一方面可以跟轉(zhuǎn)染試劑供應(yīng)商或電轉(zhuǎn)儀器供應(yīng)商溝通，詢問(wèn)對(duì)方是否有做過(guò)該細(xì)胞轉(zhuǎn)染測(cè)試，效率和參數(shù)是怎么樣的。另一方面可以在網(wǎng)上檢索文獻(xiàn)資料，看是否有人對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行過(guò)轉(zhuǎn)染操作，使用的什么方法，操作流程是怎樣的，轉(zhuǎn)染效率如何。最后結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的具體情況，優(yōu)先選擇現(xiàn)有儀器和試劑可滿足的轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行效率測(cè)試。

3.預(yù)實(shí)驗(yàn)：做好以上準(zhǔn)備，我們就可以開(kāi)始預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳轉(zhuǎn)染參數(shù)了，一般使用帶熒光標(biāo)記的載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染率的驗(yàn)證。按照事先查好的資料或者供應(yīng)商提供的轉(zhuǎn)染protocol對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染測(cè)試，測(cè)試時(shí)一般測(cè)多組實(shí)驗(yàn)參數(shù)（比如脂質(zhì)體法測(cè)DNA與轉(zhuǎn)染試劑不同用量比例、電穿孔測(cè)試不同的電轉(zhuǎn)參數(shù)，慢病毒法測(cè)試不同的MOI），轉(zhuǎn)染24h-48h后觀察轉(zhuǎn)染率，選擇效率最高且細(xì)胞狀態(tài)良好的一組進(jìn)行后續(xù)正式實(shí)驗(yàn)。如果最高的一組轉(zhuǎn)染效率都不足30%，排除操作問(wèn)題的情況下，可能是該方法不適用于這株細(xì)胞，建議更換其他轉(zhuǎn)染方法。

看完是不是覺(jué)得自己又行了呢！源井有1周達(dá)慢病毒現(xiàn)貨、慢病毒/腺病毒/腺相關(guān)病毒包裝服務(wù)及超百種細(xì)胞轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基可以助你轉(zhuǎn)染一臂之力！

如果覺(jué)得預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索轉(zhuǎn)染參數(shù)費(fèi)時(shí)又費(fèi)力，也可以選擇將繁瑣重復(fù)的細(xì)胞構(gòu)建工作交給有豐富細(xì)胞培養(yǎng)和基因編輯經(jīng)驗(yàn)的源井生物！

經(jīng)多年磨練，源井對(duì)轉(zhuǎn)染已爐火純青，不僅能輕松駕馭上述三種轉(zhuǎn)染方法，還掌握腺病毒（ADV）、腺相關(guān)病毒（AAV）等其他轉(zhuǎn)染方法，建立了一套完善的預(yù)實(shí)驗(yàn)流程及超200種常用細(xì)胞系的預(yù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)庫(kù)，不僅對(duì)常用細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染參數(shù)、單克隆形成參數(shù)、藥篩參數(shù)了如指掌，還能對(duì)接收的新細(xì)胞系進(jìn)行快速解密！更在精研的轉(zhuǎn)染專用培養(yǎng)基的加持下，實(shí)現(xiàn)THP-1、RAW264.7、MDA-MB-231、iPS/ES等較難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，為細(xì)胞構(gòu)建的后續(xù)工作打好基礎(chǔ)！

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