昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，簡稱IBEVS (Insect Baculovirus Expression Vector System) ，是四大基因工程表達(dá)系統(tǒng)之一。由于其不具有任何對哺乳動物有潛在致病性的動物病毒片段, 昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)問世以來，獲得了人們的高度重視。

美國食品藥品管理局對 BEVS 的評價為“FDA認(rèn)可 BEVS 生產(chǎn)的產(chǎn)品，它提供了新興生物制藥業(yè)的前景，尤其對于人類疾病治療和疫苗的開發(fā)，改善人類的健康和提高數(shù)百萬人的生活質(zhì)量更是如此”。

與前面AtaGenix介紹過的大腸桿菌、酵母以及后面將要介紹的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比，IBEVS 在以下四個方面具有特殊的研究價值：

1作為超高效的真核基因表達(dá)載體，生產(chǎn)有用的工程蛋白

2作為基因工程病毒殺蟲劑，提高害蟲防治效率

3研究桿狀病毒基因組的結(jié)構(gòu)與功能

4研究真核基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制

近幾年來,昆蟲桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)已成為生產(chǎn)與研究各種原核和真核蛋白有力而普及的工具。作為您身邊的蛋白表達(dá)服務(wù)專家，AtaGenix就將目前最經(jīng)典的Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢通通告訴你：

?優(yōu)勢稍多，請先喝一杯無名液體提提神~

1.由于重組病毒的分離是通過藍(lán)白斑篩選，不存在野生型和非重組型病毒污染的問題，因此不需要傳統(tǒng)繁瑣的空斑分析來純化重組病毒。

2.很大程度上縮短了重組病毒構(gòu)建所需要的時間且重組效率達(dá)到100%。

3.外源基因在昆蟲細(xì)胞內(nèi)能進(jìn)行正確折疊，表達(dá)出的目的蛋白結(jié)構(gòu)上更接近天然蛋白，且具有完整的生物學(xué)功能。

4.昆蟲細(xì)胞能對翻譯后蛋白進(jìn)行磷酸化、糖基化、?；?、信號肽切除及肽段的切割和分解等加工修飾。

5.桿狀病毒能容納大分子的插入片段，能包裝大的基因片段。

6.桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)具備在同一細(xì)胞內(nèi)同時表達(dá)多個基因的能力，既可采用不同的重組病毒同時感染細(xì)胞，也可在同一轉(zhuǎn)移載體上同時克隆兩個外源基因，表達(dá)產(chǎn)物可加工形成具有活性的異源二聚體或多聚體。

7.昆蟲細(xì)胞懸浮生長，容易放大培養(yǎng)，有利于大規(guī)模表達(dá)重組蛋白。

8.桿狀病毒對脊椎動物無感染性，現(xiàn)有研究也表明其啟動子在動物細(xì)胞中沒有活性，因此在表達(dá)癌基因或有潛在毒性的蛋白時明顯優(yōu)于其他系統(tǒng)。

那么

??問題來了，

是什么樣的組成，

支撐起了

如此多的優(yōu)勢。

和你一起，看個究竟。

來看看它的幾個組成部分。

表達(dá)載體

AtaGenix的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)采用pFastBac1載體為供體質(zhì)粒，組裝具有Tn7L和Tn7R的左右兩臂序列，兩臂序列之間是多角體蛋白的PH啟動子，然后是多克隆酶切位點和SV4的Poly A位點。且pFastBac1供體質(zhì)粒含有慶大霉素抗性基因便于篩選。

AtaGenix亦有pFastBac Dual來豐富您的選擇。其特點是在單個載體上有兩個啟動子，可以使用 Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)同時在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)兩個蛋白。該載體具有兩個強(qiáng)啟動子，多角體蛋白啟動子和 p10啟動子，可實現(xiàn)目的蛋白的高水平表達(dá)。

表達(dá)細(xì)胞器

昆蟲桿狀病毒既可在昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞中，又可在昆蟲和蛹體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。究竟采用何種表達(dá)方式，可根據(jù)外源蛋白的性質(zhì)及用途、表達(dá)水平高低、 分離純化難易、純化要求高低等因素來綜合考慮。然而，對于常規(guī)小量及高純度的蛋白質(zhì)生產(chǎn)而言，利用體外培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞來進(jìn)行表達(dá)是首選途徑。

目前應(yīng)用最為廣泛的是草地貪葉蛾(Spodoptera frugiperda)卵巢細(xì)胞系 Sf21及其克隆株 Sf9 和粉紋夜蛾( Trichoplusia ni ) 胚胎細(xì)胞系 BTI-TN5B1-4，即我們熟知的High Five。High Five細(xì)胞株較 Sf9 及Sf21 有更多優(yōu)點，其細(xì)胞增殖一代所用時間更短，并且表達(dá)量更高，更適合于重組蛋白的表達(dá)。

AtaGenix實驗室依據(jù)多年探索經(jīng)驗對sf9 （上圖為融合GFP標(biāo)簽的目的蛋白在sf9細(xì)胞中的表達(dá)情況實拍——來自普健生物）和High Five細(xì)胞株進(jìn)行了馴化，使其適合在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，且表達(dá)量大大提高。相對于胞內(nèi)表達(dá)的細(xì)胞自身本底蛋白而言，分泌表達(dá)將大大減少它在純化過程所帶來的麻煩。

放大反應(yīng)器

大規(guī)模培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞的方法很多，綜合起來可分為兩種類型：貼壁細(xì)胞培養(yǎng)和懸浮細(xì)胞培養(yǎng)。由于昆蟲細(xì)胞體積大，形狀較不規(guī)整，容易結(jié)團(tuán)，病毒感染后細(xì)胞會膨大1.5倍左右，導(dǎo)致昆蟲細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)難度增加。但AtaGenix采用搖瓶、轉(zhuǎn)瓶氣升發(fā)酵罐和灌注培養(yǎng)等方法能在氣升式和渦旋攪動式生物反應(yīng)器中大量懸浮培養(yǎng)昆蟲細(xì)胞，規(guī)模可達(dá)3-90 L，細(xì)胞倍增時間18-24 h，細(xì)胞密度可達(dá)5×106個/mL，與傳統(tǒng)的貼壁培養(yǎng)相接近，可以滿足不同的實驗需求。

經(jīng)典案例

AtaGenix一直致力于從以上各個方面進(jìn)行昆蟲蛋白表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化，其成果得到業(yè)界人士的一致肯定。例如，在AtaGenix利用昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)為客戶提供蛋白表達(dá)純化服務(wù)的一個案例中，經(jīng)過P1代病毒生產(chǎn)及表達(dá)測試（見Figure 1）和P2代病毒生產(chǎn)及表達(dá)條件優(yōu)化（見Figure 2），目的蛋白的表達(dá)量達(dá)300 mg/L（見Figure 3），目的蛋白經(jīng)客戶測試顯示有活性，服務(wù)效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出了客戶的預(yù)期。

Figure 1.SDS-PAGE analysis of protein B for P1 expression.

SDS-PAGE: Coomassie blue Staining. 1 and 2 mean different clones；-. Negative control.

Figure 2. Protein B Expression Tests in sf9 and Hi5.?

Coomassie blue Staining. -. Negative control

Figure 3.Purification result and the final QC of?

Protein B.

Coomassie blue Staining.

作為您實驗室的最佳合作伙伴之一，AtaGenix將不遺余力地為您在科研道路上貢獻(xiàn)一份力量。我們希望您在技術(shù)的海洋中一帆風(fēng)順，更希望當(dāng)你需要遮風(fēng)擋雨時，能想起我們這把傘。普健生物，一個專注蛋白表達(dá)和抗體定制的企業(yè)，術(shù)業(yè)有專攻，僅此而已。