線粒體是細胞的動力源，因為它們以三磷酸腺苷（ATP）的形式產(chǎn)生了大部分的能量供應。線粒體是一種雙膜細胞器：一種外膜和一種折疊的內(nèi)膜，稱為嵴。分離的線粒體是研究線粒體呼吸、呼吸復合體組裝、細胞凋亡、mtDNA和mtRNA以及線粒體蛋白分析的首選樣本。

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Biogradetech線粒體提取試劑盒為分離完整的線粒體提供了兩種選擇。第一種選擇是利用一種基于試劑的方法，允許平行處理多個樣品。第二種選擇使用傳統(tǒng)的跳躍均質(zhì)化，這提供了更好的線粒體產(chǎn)量。

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微光應用程序：

從組織和培養(yǎng)細胞中分離出高純度、完整和有功能的線粒體。

線粒體呼吸研究，復合物的組裝，細胞凋亡，mtDNA和mtRNA，以及蛋白質(zhì)譜分析。

西方印跡和ELISA。

線粒體提取樣品類型：

哺乳動物組織。

培養(yǎng)細胞。

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儲存和處理：

存儲工具包在-20°C，避光。在使用前解凍試劑。在進行實驗前，請讀取整個方案。

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艾美捷?線粒體提取試劑盒?（D-AKE4003-50T）分離方案：

1.樣品制備：

a.?培養(yǎng)細胞：小顆粒2 x107細胞在600 xg下離心10 min。小心地去除并丟棄上清液。

b.?組織：分離出感興趣的組織。將組織（50-200 mg）浸泡在1毫升冰冷的線粒體分離緩沖液中，并沖洗兩次以除去血液。用1毫升冰冷的線粒體分離緩沖液，用剪刀將放在冰上的組織切成小塊。將切碎的組織在桌面離心機中以10000xg旋轉2 min。棄用緩沖液，換上1 ml新鮮冰冷的線粒體分離緩沖液。

2.線粒體分離的程序：

a.使用Dounce均質(zhì)器分離線粒體：在線粒體分離緩沖液中使用預冷玻璃均質(zhì)器對組織或細胞進行均質(zhì)化。在冰上敲擊樣品3-4次。組織或細胞與線粒體分離緩沖液之間的最佳比例范圍為1：5-1：10（w/v）。將勻漿轉移到試管中，以600 x g離心10 min。在4°C。將上清液收集于單管中，7000xg離心10 min。在4°C。棄出上清液，再次用線粒體分離緩沖液清洗顆粒。取出上清液，在存儲緩沖液中重懸線粒體。確定蛋白質(zhì)濃度，并使用存儲緩沖液調(diào)整到所需的蛋白質(zhì)濃度。

b.基于試劑分離線粒體方法：在細胞顆粒中加入1 ml線粒體分離緩沖液，渦旋5秒，冰孵育2 min。加入10μl試劑A，渦旋5秒。冰敷5 min。同時每分鐘旋轉一次。持續(xù)5秒。600 x g離心機，離心機為10 min。在4°C。將上清液收集于單管中，7000xg離心10 min。在4°C。棄出上清液，用線粒體分離緩沖液清洗顆粒。取出上清液，在存儲緩沖液中重懸線粒體。確定蛋白質(zhì)濃度，并使用存儲緩沖液調(diào)整到所需的蛋白質(zhì)濃度。

記下

a.為了避免蛋白質(zhì)降解，建議您在線粒體分離緩沖液中加入蛋白酶抑制劑雞尾酒。

b.均質(zhì)化的中風次數(shù)將取決于細胞或組織類型的不同。

c.對于細胞，為了檢查細胞裂解效率，將5μl的細胞裂解液涂成載玻片，加入蓋層，在顯微鏡下觀察。對于組織，進行足夠的中風以獲得均勻的懸浮液而不溶解細胞。通常對于軟組織，10,15次中風和對于硬組織，5-10次中風就足夠了。

3.基于應用程序的存儲條件：對于完整的線粒體，在存儲緩沖液中重懸。保持冰立即使用或在液氮中快速冷凍，儲存在-80°C以備將來使用。為了裝載凝膠的目的，線粒體可以存儲在適當?shù)臉悠稰AGE緩沖液中（未提供）。

圖：線粒體完整性檢測：按照上述方案，從小鼠肝臟中純化出線粒體（100μg）。用JC-1染料檢測純化后的線粒體的完整性，該染料檢測線粒體內(nèi)膜的電化學化質(zhì)子梯度（ΔΨ）。將純化后的線粒體放在冰上解凍，并與JC-1染料（1μg/ml）孵育15 min。在37°C。完整的純化線粒體顯示JC-1染料的聚集，其信號可以在Ex/Em = 530/590 nm處測量。用抗霉素A（100μM）處理可消散線粒體膜電位，導致熒光信號降低。

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*僅供研究使用！不能用在人類身上