前言

蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)。基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)是研究全球蛋白質(zhì)豐度的一種非常適合和廣泛使用的分析工具。

StevenA.Carr麻省理工學(xué)院和哈佛大學(xué)博德研究所在Mol. Cell. Proteomics期刊發(fā)表的題為“Streamlined Protocol for Deep Proteomic Profiling of FAC-sorted Cells and Its Application to Freshly Isolated Murine Immune Cells”（IF：7.3）的文章，該研究已經(jīng)開(kāi)發(fā)出來(lái)一種簡(jiǎn)化且易于獲取的樣品制備方案，能夠直接從流式細(xì)胞儀上獲得相對(duì)數(shù)量較少的基于TMT的小鼠免疫細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，深度超過(guò)7000個(gè)定量蛋白。這些數(shù)據(jù)概括了免疫學(xué)的許多方面，提出了新的細(xì)胞類(lèi)型特異性蛋白標(biāo)記，并為整個(gè)免疫系統(tǒng)的基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控提供了證據(jù)。

研究背景

蛋白質(zhì)組學(xué)是以蛋白質(zhì)組為研究對(duì)象，研究細(xì)胞、組織或生物體蛋白質(zhì)組成及其變化規(guī)律的科學(xué)。基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)是研究全球蛋白質(zhì)豐度的一種非常適合和廣泛使用的分析工具。

典型的蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程通常受到深度定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析所需的樣本輸入量的限制。為了滿足這一需求，該所開(kāi)發(fā)了一種易于實(shí)現(xiàn)的、精簡(jiǎn)的工作流程，可以從每個(gè)實(shí)驗(yàn)條件下大約2 μg的蛋白質(zhì)輸入量中進(jìn)行定量蛋白質(zhì)組分析。

研究思路

研究結(jié)果

1、低輸入蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備方法的研究進(jìn)展

實(shí)驗(yàn)開(kāi)發(fā)的簡(jiǎn)易的收集微反應(yīng)器，可以有效地捕獲和洗滌FACs分選細(xì)胞，并對(duì)少量細(xì)胞進(jìn)行裂解和消化，然后，可以將消化液直接轉(zhuǎn)移到反應(yīng)器。為了將收集微反應(yīng)器與標(biāo)準(zhǔn)離心管進(jìn)行比較，研究員將初級(jí)B細(xì)胞直接分裝到試管和反應(yīng)器，并比較這兩種方法鑒定的多肽數(shù)量。收集微反應(yīng)器在單次掃描、無(wú)標(biāo)記LC-MS/MS模式下識(shí)別不同肽段的表現(xiàn)優(yōu)于試管，并且具有更大的總離子電流(TIC)。

通過(guò)對(duì)低輸入樣本進(jìn)行多路復(fù)用，結(jié)合多個(gè)實(shí)驗(yàn)的信號(hào)，提高了MS1信號(hào)強(qiáng)度，提高了數(shù)據(jù)采集的整體靈敏度。實(shí)驗(yàn)測(cè)試了柱上TMT標(biāo)記能產(chǎn)生更高比例的標(biāo)記多肽，比標(biāo)準(zhǔn)方案的重復(fù)性更強(qiáng)(圖3A)。與溶液內(nèi)標(biāo)記相比，柱上標(biāo)記方法的肽段圖譜匹配(PSMs)也增加了27%(圖3B)。

最后，柱上TMT標(biāo)記避免了額外的脫鹽步驟，并將整個(gè)標(biāo)記方案從大約3小時(shí)減少到10分鐘以內(nèi)(圖3C)。這些結(jié)果表明，柱上TMT標(biāo)記策略對(duì)低微克水平的多肽標(biāo)記更快、更有效。

2、FACs分選免疫細(xì)胞的深度定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

通過(guò)對(duì)比SCX 、bC18、bSDB三種方法可以發(fā)現(xiàn)，分選提高了TMT標(biāo)記肽段的數(shù)量(圖4A)。bSDB分餾在PSM數(shù)量上優(yōu)于bC18分餾，在之后的餾分中鑒定出的分析物具有更高的前驅(qū)體強(qiáng)度，且餾分的肽段唯一性更強(qiáng)(圖4A-4C)。將bC18和bSDB各自的步驟餾分中鑒定的肽段的保留時(shí)間(RT)與未分餾樣品的RT進(jìn)行比較，結(jié)果顯示肽段在bSDB餾分中的分布更加均勻(圖4D)，這些數(shù)據(jù)表明，bSDB是一種正交的，非常適合于分離少量TMT標(biāo)記肽的方法。

3、差異豐富和免疫細(xì)胞類(lèi)型特異性蛋白的鑒定

蛋白的原始數(shù)據(jù)先進(jìn)行刪除缺失值再進(jìn)行歸一化處理，然后取差異表達(dá)的前20個(gè)差異蛋白:即取一種細(xì)胞類(lèi)型中與其他細(xì)胞類(lèi)型相比最大的20倍變化值，計(jì)算出Top 20個(gè)差異表達(dá)基因。對(duì)蛋白質(zhì)差異倍數(shù)作圖，經(jīng)過(guò)調(diào)節(jié)F檢驗(yàn)，根據(jù)樣本兩兩間的Pearson進(jìn)行相關(guān)性聚類(lèi)。又經(jīng)過(guò)主成分分析(PCA)對(duì)前13%的蛋白質(zhì)進(jìn)行任意截點(diǎn)，F(xiàn)統(tǒng)計(jì)量最高(FC值高，精度高)。15%是Immgen相關(guān)研究中常用到的閾值。通過(guò)基因集富集分析(GSEA)對(duì)PC1和PC2的基因集進(jìn)行分析，從而驗(yàn)證通路驅(qū)動(dòng)的轉(zhuǎn)錄與蛋白的關(guān)系。

4、蛋白質(zhì)/RNA關(guān)系揭示了整個(gè)免疫系統(tǒng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的證據(jù)

為了分析協(xié)同調(diào)控，分析計(jì)算了所有成對(duì)mRNA、蛋白之間的歐氏距離并聚類(lèi)。為了在蛋白質(zhì)水平上觀察到mRNA共同調(diào)控之間的差異，按mRNA聚類(lèi)的順序繪制了蛋白質(zhì)不同細(xì)胞類(lèi)型的相關(guān)性。通過(guò)對(duì)每種細(xì)胞類(lèi)型的每種基因產(chǎn)物的表達(dá)水平進(jìn)行排名，計(jì)算表達(dá)等級(jí)。跟據(jù)Delta-rank分析計(jì)算了每個(gè)細(xì)胞的每個(gè)基因產(chǎn)物的Delta-rank值。通過(guò)計(jì)算和聚類(lèi)重疊測(cè)量的5125個(gè)基因產(chǎn)物的ρ值來(lái)尋找mRNA和蛋白質(zhì)的共同調(diào)控。mRNA和蛋白數(shù)據(jù)均顯示出各自不同的富集通路和共同富集的通路，提示本研究中不同免疫細(xì)胞類(lèi)型之間存在共調(diào)控(圖7B-7C)。

按照mRNA數(shù)據(jù)的聚類(lèi)順序重新排列蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)明顯缺失和非對(duì)角相關(guān)性(圖7D)，這表明初級(jí)小鼠免疫細(xì)胞對(duì)所需的蛋白質(zhì)格局顯示出一定程度的轉(zhuǎn)錄共調(diào)控緩沖。通過(guò)GSEA分析，將這些基因集的基因產(chǎn)物進(jìn)行組合并用于下游的分析。對(duì)單個(gè)細(xì)胞類(lèi)型的TLR基因集中的delta-rank基因產(chǎn)物水平進(jìn)行聚類(lèi)分析。在RNA水平相對(duì)較低、蛋白質(zhì)水平較高的細(xì)胞類(lèi)型中，基因產(chǎn)物將具有一個(gè)較大的表達(dá)。（圖7F）

研究結(jié)論

實(shí)驗(yàn)將低輸入蛋白質(zhì)組樣品制備方法應(yīng)用于根據(jù)Immgen協(xié)議分類(lèi)的12種新鮮分離的小鼠免疫細(xì)胞類(lèi)型。據(jù)悉這項(xiàng)研究首次提供了來(lái)自其常駐組織而非外周血的主要免疫細(xì)胞類(lèi)型的蛋白質(zhì)組特性。從小鼠重復(fù)之間的高重復(fù)召回率可以看出，超過(guò)7000個(gè)蛋白質(zhì)的高重復(fù)性被定量。

本次研究的低輸入蛋白質(zhì)組學(xué)將以往方法的適用性擴(kuò)展到FACs分類(lèi)的免疫細(xì)胞，并強(qiáng)調(diào)了減少處理樣品制備的價(jià)值，特別是那些需要分析有限數(shù)量的樣品。后續(xù)希望這些方法將使研究人員能夠?qū)σ郧盁o(wú)法獲得的稀缺樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)實(shí)驗(yàn)。

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