前 言

重組腺相關(guān)病毒 (AAV) 載體由于其良好的安全性、高轉(zhuǎn)導(dǎo)效率和在非分裂細(xì)胞中的長(zhǎng)期基因表達(dá)，已發(fā)展成為最有前途的基因治療技術(shù)?；?AAV 的基因療法對(duì)于治療遺傳性失明、肌肉萎縮或出血性疾病等遺傳疾病具有很大的前景。存在多種天然存在的和工程改造的 AAV 血清型，它們的衣殼序列不同，因此在細(xì)胞嗜性上有所不同，在AAV研發(fā)工作中快速地評(píng)估不同血清型的AAV是十分重要的。

# 文獻(xiàn)解讀 #

在這篇文章里，作者提出使用nanoDSF 技術(shù)測(cè)量，作為確定 AAV 衣殼 Tm 的一種簡(jiǎn)單替代方法。該研究表明，nanoDSF 測(cè)量是一種簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確和快速的 SO-DSF 替代方案，它能夠以出色的精度表征 AAV 衣殼穩(wěn)定性，并且不需要任何其他染料。

AAV 顆粒由 3 個(gè)結(jié)構(gòu)病毒蛋白（VP1、VP2 和 VP3）和一個(gè)大約 4.7 kb 的單鏈 DNA 基因組組成，其中包含 2 個(gè)反向末端重復(fù)序列 (ITR) 之間的 2 個(gè)基因 Rep 和 Cap。Rep 編碼多種非結(jié)構(gòu)性 Rep 蛋白，這些蛋白對(duì)于病毒基因組復(fù)制和包裝至關(guān)重要。Cap 包含一個(gè)開放閱讀框，它以大約 1:1:10 的比例從不同的起始密碼子產(chǎn)生 VP1、VP2 和 VP3 蛋白。

不同的 AAV 血清型不僅具有不同的細(xì)胞趨向性和轉(zhuǎn)導(dǎo)譜，而且它們的結(jié)構(gòu)特性和穩(wěn)定性也不同。后一個(gè)特征也反映在熱穩(wěn)定性上，并導(dǎo)致衣殼的血清型特異性解鏈溫度 (Tm)。nanoDSF 方法基于 AAV 衣殼蛋白序列中色氨酸殘基的內(nèi)在熒光，其在 AAV 血清型中高度保守，其光譜特性取決于其局部環(huán)境。從疏水環(huán)境到親水環(huán)境的變化會(huì)導(dǎo)致在紫外范圍內(nèi)激發(fā)時(shí)色氨酸的發(fā)射光譜發(fā)生紅移。通過這種簡(jiǎn)單的測(cè)量，可以在 1 小時(shí)內(nèi)確定不同 AAV 血清型的 Tm，檢測(cè)濃度大約 2Ⅹ1011?cp/mL，樣品體積僅為 10 μL。

文中作者對(duì)不同血清型的AAV進(jìn)行了檢測(cè)，并且檢測(cè)了不同生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)的AAV都是可以得到很好的區(qū)分，其中，除了AAV3/AAV8及AAV9/AAV10這兩對(duì)不能很好的有效區(qū)分，作者報(bào)導(dǎo)對(duì)于其他AAV血清型都是可以很好的快速區(qū)分的，并且儀器的準(zhǔn)確度與重復(fù)性都是十分優(yōu)秀的。

為了檢測(cè)儀器的對(duì)不同血清型AAV的區(qū)分度，作者使用不同血清型的AAV進(jìn)行混合后，如上圖所示，不同比例混合下的AAV可以很好的在Promethus上得到區(qū)分。而檢測(cè)樣品的濃度可以低至2Ⅹ1011?cp/mL，樣品體積僅為 10 μL，可以很好的節(jié)省實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行更多地其他分析。

在本研究中，使用nanoDSF方法來(lái)確定AAV衣殼的Tm，作為血清型鑒定的方法。使用nanoDSF測(cè)量Tm是一種簡(jiǎn)單、快速（30-60分鐘）和高通量（48個(gè)樣品/30-60分鐘）的方法，用于以低成本和低材料輸入（2Ⅹ1011cp/mL，10 μL）測(cè)定AAV-Tm，從最終產(chǎn)品和過程控制樣品中很容易獲得如此少量的材料。由于nanoDSF測(cè)量也允許檢測(cè)與工藝相關(guān)的雜質(zhì)，因此該方法是一種非常有吸引力的高通量篩選方法，用于在純化過程中監(jiān)測(cè)樣品純度和分析批次間的一致性。

盡管 nanoDSF 可以快速可靠地確定 Tm，因此可以了解 AAV 衣殼的類型，但最明顯的問題是具有非常相似的熱穩(wěn)定性水平的 AAV 衣殼，例如 AAV3 和 AAV8 或 AAV9 和 AAVrh10無(wú)法進(jìn)行區(qū)分。但這一限制可以通過測(cè)量不同的緩沖液來(lái)克服，在這些緩沖液中，AAV 血清型表現(xiàn)出不同的熱穩(wěn)定性并允許區(qū)分對(duì)。除此之外，該方法很容易區(qū)分所有AAV血清型表現(xiàn)出不同的熱穩(wěn)定性并被有效區(qū)分出來(lái)。此外，可以精確測(cè)量 AAV的混合物，并且可以在 1:10 的濃度比下區(qū)分 1 個(gè)樣品中的 2 種血清型。由于nanoDSF方法在常用的配方和儲(chǔ)存緩沖液及洗滌劑中具有獨(dú)特的穩(wěn)定性，不會(huì)受到緩沖液成分影響，因此它為AAV血清型鑒定提供了一種快速、經(jīng)濟(jì)、可靠的方法。