歐易BD平臺(tái)單細(xì)胞客戶文章來(lái)了！單細(xì)胞測(cè)序持續(xù)發(fā)力！近日，復(fù)旦大學(xué)周祥、吳小華教授為共同通訊作者，在Clinical and Translational Medicine?(IF: 11.492)期刊發(fā)表了關(guān)于高級(jí)別漿液性卵巢癌的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序相關(guān)成果，揭示了高級(jí)別漿液性卵巢癌的異質(zhì)性和潛在治療靶點(diǎn)。歐易生物提供了該項(xiàng)目單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析相關(guān)工作，下面我們一起學(xué)習(xí)這篇文章的具體內(nèi)容。

?基本信息?

材料：?2個(gè)病人原發(fā)和轉(zhuǎn)移配對(duì)的HGSOC樣本

期刊：Clinical and Translational Medicine

發(fā)表時(shí)間：2021年7月30日

方法：歐易生物BD Rhapsody scRNA-seq

研究背景和研究目的

高級(jí)別漿液性卵巢癌?(HGSOC)?是最常見(jiàn)的上皮性卵巢癌，對(duì)該疾病的異質(zhì)性和分子基礎(chǔ)仍然不完全了解。HGSOC是最具侵襲性的婦科惡性腫瘤，也是全球女性癌癥死亡的主要原因之一。探究HGSOC的異質(zhì)性和分子特征，有助于更好地理解卵巢癌發(fā)生、轉(zhuǎn)移和耐藥性的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn)。

?內(nèi)容概述?

總共獲得13,571個(gè)細(xì)胞，分為六種不同的細(xì)胞類型，包括：上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。作者鑒定出一種具有高增殖和耐藥性潛力的上皮細(xì)胞亞群，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)了它們?cè)诼殉舶┘?xì)胞生長(zhǎng)和遷移中的作用。通過(guò)擬時(shí)序分析，發(fā)現(xiàn)包括翻譯機(jī)制在內(nèi)的多種信號(hào)通路的失調(diào)與卵巢癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。此外，SCENIC分析揭示了基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的相互作用，并通過(guò)JUN/AP-1抑制劑T-5224驗(yàn)證，表明JUN可作為潛在的卵巢癌治療靶點(diǎn)。

?研究結(jié)果?

1.?scRNA-seq圖譜揭示HGSOC中的不同細(xì)胞類型與CNV分析

對(duì)兩個(gè)患者的4個(gè)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性HGSOC樣本進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序?(Figure 1A)，聚類為9個(gè)cluster (Figure 1B)，利用marker基因鑒定為6種細(xì)胞類型?(Figure 1B, C, D)。CNV分析發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞的CNV水平顯著高于其他細(xì)胞類型?(Figure 1E, F)。

Figure 1. 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)描述HGSOC中不同的細(xì)胞類型

2.?HGSOC中上皮細(xì)胞的獨(dú)特分子特征?

為了進(jìn)一步研究上皮細(xì)胞功能特征，作者對(duì)上皮細(xì)胞進(jìn)一步分亞群?(Figure 2A, B)后進(jìn)行GSVA分析?(Figure 2C)。不同亞群表現(xiàn)出了不同的功能性，EC1富集了糖酵解/糖異生、檸檬酸循環(huán)等相關(guān)信號(hào)通路?(Figure 2C, D)，EC2富集了細(xì)胞因子間受體相互作用以及神經(jīng)活性相關(guān)信號(hào)通路?(Figure 2C, E)。而EC3富集了核苷酸和氨基酸代謝相關(guān)信號(hào)通路，并且上調(diào)了參與范科尼貧血途徑和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，表明該亞群可能具有耐藥性?(Figure 2C, F)。EC4富集了免疫應(yīng)答、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)的信號(hào)通路，并且上調(diào)了MHC-II相關(guān)基因?(Figure 2C, G)，表明這組細(xì)胞在抗原處理和免疫反應(yīng)中能力較強(qiáng)。EC5富集了細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、損傷修復(fù)和藥物代謝相關(guān)的信號(hào)通路，并且增殖相關(guān)基因MKI67和耐藥相關(guān)基因與同源重組基因的表達(dá)上調(diào)?(Figure 2C, H)，表明這些細(xì)胞可能對(duì)化療和PARP抑制劑具有抗性。同時(shí)細(xì)胞周期分析發(fā)現(xiàn)EC5主要由S期和G2/ M期癌細(xì)胞組成?(Figure 2I)，也表明EC5具有較強(qiáng)的增殖潛能。

作者在五個(gè)亞群TOP25 SDE（significantly differentially expressed）基因中發(fā)現(xiàn)了一些可能與卵巢癌有關(guān)的新marker。為了進(jìn)一步驗(yàn)證marker的功能，使用細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了ANPEP ?(EC2)、CASP14和CLEC2B (EC3)、CADM3和NRBP2 (EC4)、SPC25和ESCO2和GTSE1 (EC5)?與卵巢癌細(xì)胞增殖的關(guān)系，結(jié)果表明抑制8個(gè)基因的表達(dá)，均會(huì)導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞的增殖能力下降?(Figure 3A)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) (Transwell)?表明抑制8個(gè)基因中的任何一個(gè)基因的表達(dá)都會(huì)顯著降低OVCA420細(xì)胞的侵襲能力?(Figure 3B)。

Figure 2. 上皮細(xì)胞亞型具有顯著的分子特征

Figure?3.?上皮細(xì)胞marker功能驗(yàn)證

3.?HGSOC發(fā)展過(guò)程中的動(dòng)態(tài)基因表達(dá)譜

為探究HGSOC發(fā)育過(guò)程中基因變化情況，作者通過(guò)擬時(shí)序分析發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間增加轉(zhuǎn)移性上皮細(xì)胞占比逐漸增高?(Figure 4A, B, E, F)，并通過(guò)分析基因變化情況發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期和分裂、DNA修復(fù)、炎癥和代謝途徑，特別是糖酵解和檸檬酸循環(huán)在卵巢癌發(fā)展過(guò)程中明顯失調(diào)?(Figure 4C, D, G, H)。其中許多核糖體生物合成和翻譯相關(guān)基因在腫瘤細(xì)胞進(jìn)化過(guò)程中上調(diào)?(Figure 4D)，驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)核糖體生物合成相關(guān)基因的高表達(dá)與卵巢癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)?(Figure 4I)。而纖毛上皮marker (FOXJ1、PIGR、CAPS和GDF15) 在腫瘤發(fā)展過(guò)程中表現(xiàn)出下降趨勢(shì)?(Figure 4D)，同時(shí)這些marker的低表達(dá)導(dǎo)致了預(yù)后效果較差?(Figure 4J)。此外，作者發(fā)現(xiàn)卵巢癌的進(jìn)展伴隨著免疫應(yīng)答相關(guān)基因的表達(dá)下調(diào)?(Figure 4H)，其下調(diào)與不良預(yù)后顯著相關(guān)?(Figure 4K)。以上結(jié)果表明卵巢癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中幾個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路的失調(diào)與卵巢癌的預(yù)后顯著相關(guān)。

Figure 4. HGSOC轉(zhuǎn)移過(guò)程中的基因表達(dá)譜

4.?HGSOC中成纖維細(xì)胞特征分析

成纖維細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤中高度豐富和異質(zhì)性的細(xì)胞類群，因此作者對(duì)HGSOC中的成纖維細(xì)胞進(jìn)一步做亞群分析?(Figure 5A, B)。為進(jìn)一步研究不同亞型間的功能差異，通過(guò)GSVA分析對(duì)成纖維細(xì)胞亞群進(jìn)行功能注釋?(Figure 5C)，結(jié)果表明FC1富集了脂質(zhì)和類固醇代謝的相關(guān)通路?(Figure 5C, D)，F(xiàn)C2富集了糖代謝（糖酵解與糖異生、檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化）以及多種DNA修復(fù)途徑相關(guān)通路?(Figure 5C, E)，表明FC2可能具有腫瘤樣惡性潛能。FC3中免疫應(yīng)答和感染性疾病相關(guān)基因上調(diào)，表明它們可能與腫瘤免疫相關(guān)?(Figure 5C, F)。而FC4富集了大量血管發(fā)生相關(guān)信號(hào)通路?(Figure 5G)，表明該亞群在血管發(fā)育和血管生成中具有重要作用。在FC5中發(fā)現(xiàn)脂質(zhì)代謝途徑和細(xì)胞外基質(zhì)信號(hào)通路大量富集?(Figure 5C)，并上調(diào)了與發(fā)育、組織再生相關(guān)的基因表達(dá)?(Figure 5H)。這些結(jié)果揭示了HGSOC成纖維細(xì)胞的異質(zhì)性，可以在誘發(fā)耐藥性、免疫抑制、血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移方面來(lái)推動(dòng)卵巢癌的進(jìn)展。?

Figure 5. 成纖維細(xì)胞亞型特征分析

5. 基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)確定JUN通路是HGSOC的驅(qū)動(dòng)因子

接下來(lái)，作者對(duì)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行SCENIC分析?(Figure 6A-D)，結(jié)果表明JUN在3組高調(diào)控模塊中調(diào)控活性較高?(Figure 6A-F)。為進(jìn)一步探究JUN蛋白在卵巢癌進(jìn)展中的作用，作者使用JUN/AP-1抑制劑T-5224對(duì)卵巢癌細(xì)胞進(jìn)行活力實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明T-5224顯著抑制了OVCA420和ES-2細(xì)胞的增殖?(Figure 6D, H)。同時(shí)作者通過(guò)Transwell實(shí)驗(yàn)表明T-5224可以有效的抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力?(Figure 6I, J)。以上結(jié)果表明JUN可以作為卵巢癌潛在的治療靶點(diǎn)。

Figure 6. HDSOC基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

6.?HGSOC中上皮細(xì)胞-成纖維細(xì)胞間的通訊網(wǎng)絡(luò)

為進(jìn)一步了解上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的通訊作用關(guān)系，作者使用cellphoneDB對(duì)上皮細(xì)胞和成纖維之間進(jìn)行通訊分析?(Figure 7A, B)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在上皮細(xì)胞中表達(dá)較高的EGFR、FGFR1和FGFR2，其相應(yīng)配體如CopA、GRN、HBEGF、FGF2、FGF7和FGF18等在成纖維細(xì)胞中廣泛表達(dá)?(Figure 7C, E)。FGFR2-TIMP1和HLA-DRB1-OGN在上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間表現(xiàn)出最活躍的受體-配體相互作用。另一方面在比較原發(fā)性與轉(zhuǎn)移性腫瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)EGFR-COPA/GRN/HBEGF受體-配體相互作用對(duì)的表達(dá)水平明顯不同，在轉(zhuǎn)移性腫瘤中顯著高表達(dá)，表明其可能在卵巢癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。此外，盡管成纖維細(xì)胞也表達(dá)EGFR和FGFR1等受體，但是它們更多地表達(dá)高水平受體如LRP1、PDGFRs、PLXND1等，而上皮細(xì)胞則表達(dá)相應(yīng)配體?(LGALS9/MDK、PDGFs、Semas) (Figure 7D, F)?？傊@些結(jié)果表明上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞之間的細(xì)胞通訊可能會(huì)影響卵巢癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。

Figure 7. HGSOC中上皮細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的通訊網(wǎng)絡(luò)

? 結(jié)論??

1. HGSOC樣本的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析揭示了六種不同的細(xì)胞類型，鑒定了HGSOC中上皮細(xì)胞的新marker，并進(jìn)一步證實(shí)了它們?cè)诼殉舶┘?xì)胞增殖和侵襲中的作用；

2. 發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞多種信號(hào)通路的失調(diào)與卵巢癌轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)；

3. 探究了成纖維細(xì)胞亞型的功能異質(zhì)性；

4. 揭示了JUN可作為HGSOC潛在治療靶點(diǎn)；

5. 描述細(xì)胞通訊網(wǎng)絡(luò)的關(guān)系，揭示卵巢癌的關(guān)鍵受體-配體相互作用。

?特別致謝?

致謝歐易生物巴永兵和董嬌陽(yáng)在生物信息分析中提供的幫助。

?參考文獻(xiàn)?

Hao Q, Li J, Zhang Q,?et al. Single-cell transcriptomes reveal?heterogeneity of high-grade serous ovarian?carcinoma.?Clin Transl Med. 2021;11:e500.