研究背景：?

胰腺導管腺癌（PDAC）是一種高度致命的惡性腫瘤，通常在晚期被診斷，對化療和電離輻射的反應最小。在過去的十年中，大規(guī)模的全基因組測序分析揭示了復雜的突變情況，90%以上的PDAC腫瘤擁有KRAS的致癌突變，50%-75%的患者發(fā)生TP53、SMAD4和CDKN2A的失活。然而，其他基因的突變發(fā)生頻率較低，并導致腫瘤內(nèi)和腫瘤間的顯著異質(zhì)性。毫不奇怪，采用非選擇性方法的治療策略可能效果有限。盡管有這樣的異質(zhì)性，PDAC患者中的一個亞群，構(gòu)成了高達25%的病例，擁有參與DNA損傷反應（DDR）的基因突變。這些突變大多發(fā)生在參與同源重組-修復（HR-修復）途徑的DDR基因中。在賦予HR缺陷（HRD）的突變中，在所有PDAC患者中的4%-7%觀察到種系BRCA1和BRCA2突變。值得注意的是，這些基因的突變頻率在高危人群中接近20%。此外，PDAC腫瘤患者的全基因組測序表明，另有7%沒有這些已知突變的患者具有HRD的特征。

科學問題：?

胰腺導管腺癌（PDAC）是一種高度致命的惡性腫瘤，對化療和電離輻射的反應很小。大規(guī)模全基因組測序分析揭示了復雜的突變譜系，超過90%的PDAC腫瘤攜帶KRAS的致癌突變，50%至75%的患者缺乏TP53、SMAD4和CDKN2A基因的功能。然而，其他基因的突變頻率較低，并導致顯著的腫瘤內(nèi)和腫瘤間異質(zhì)性。不足為奇的是，采用非選擇性方法的治療策略可能有效性有限。盡管存在這種異質(zhì)性，PDAC患者中一個亞群（約25%）攜帶與DNA損傷應答（DDR）相關的基因突變。其中，大多數(shù)突變發(fā)生在與同源重組修復（HR修復）途徑相關的DDR基因中。在HR缺陷（HRD）中，BRCA1和BRCA2的突變在所有PDAC患者中觀察到的頻率為4%-7%。值得注意的是，在高風險人群中，這些基因的突變頻率接近20%。此外，對PDAC患者腫瘤的全基因組測序研究表明，還有7%的患者沒有這些已知突變，但存在HRD的特征。

研究結(jié)果和結(jié)論：?

研究結(jié)果顯示，在HR缺陷的胰腺癌模型中，POLQ敲降與BRCA1、BRCA2以及ATM等HR基因突變合并使用時具有合成致死性。此外，研究發(fā)現(xiàn)，POLQ抑制引起細胞質(zhì)DNA的積累，激活cGAS-STING信號通路，從而增強BRCA2缺乏的胰腺腫瘤內(nèi)T細胞的浸潤。同時，POLQ抑制對HR缺陷的PDAC細胞呈現(xiàn)出合成致死性，并與PARPi在HR缺陷PDAC細胞中產(chǎn)生協(xié)同作用。

綜上所述，POLQ在HR缺陷的胰腺癌中是一個有前景的治療靶點。研究結(jié)果為針對POLQ的抑制提供了合成致死性方法，可以阻止腫瘤生長，并與現(xiàn)有療法聯(lián)合使用。此外，研究還揭示了POLQ在調(diào)節(jié)腫瘤免疫環(huán)境中的新作用，通過激活cGAS-STING信號通路增強腫瘤內(nèi)T細胞的浸潤。這些發(fā)現(xiàn)為開發(fā)HR缺陷PDAC的新療法提供了依據(jù)。

▉結(jié)果：

1.同源重組缺陷（HR-deficient）以及遺傳不穩(wěn)定的PDAC腫瘤中POLQ表達增加

為了評估POLQ在PDAC中表達的臨床意義，以前的大規(guī)模研究表明，多達25%的人類PDAC腫瘤存在賦予HRD的突變。當對來自癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)集的158個切除的PDAC樣本進行分析時，HRD評分的升高與POLQ的高表達有關（圖1A）。Waddell等人利用基因組數(shù)據(jù)確定了PDAC的4個亞型，指出具有不穩(wěn)定基因組的腫瘤在DDR基因中藏有突變。當把這些基因組結(jié)構(gòu)組別應用于晚期PDAC綜合分子特征以改善治療選擇研究中的晚期患者隊列時，POLQ在具有不穩(wěn)定基因組結(jié)構(gòu)的腫瘤中表達最高（P=3.78e-07，圖1B）。

為了評估PDAC中POLQ表達的臨床意義，評估了與POLQ表達有關的PDAC患者的總生存率。利用TCGA隊列，產(chǎn)生了一個生存圖，比較了POLQ表達量排名前30%和后30%的樣本。POLQ表達水平升高與生存率下降明顯相關（P = 0.028，圖1C）。

在HR缺陷的PDAC中，POLQ的失活引起合成死亡并誘發(fā)DNA損傷。為了分析POLQ的抑制會阻止HR缺陷型PDAC的生長，采用了缺乏BRCA1、BRCA2或ATM的小鼠PDAC細胞系，并評估了POLQ存在和不存在時的細胞增殖和菌落形成。這些細胞系建立于表達致癌性LSL-KrasG12D/+; LSL-Trp53R172H/+; Pdx1-Cre (KPC)的基因工程PDAC小鼠模型的腫瘤，與攜帶Brca1、Brca2或Atm基因的條件性等位基因的小鼠雜交，產(chǎn)生KPC-Brca1/-, KPC-Brca2/-, KC-Atm-/-小鼠。由于Cre只在胰腺上皮系中表達，這種等位基因的組合導致HR和DDR基因在胰腺中被專門刪除。隨后形成的胰腺腫瘤與缺乏HR或DDR的人類PDAC相似。

細胞被對照shRNA或shRNA POLQ1或-2轉(zhuǎn)導，POLQ敲除明顯減少了KPC-Brca2-/-細胞的集落形成（圖2A），而在對照的KPC細胞中沒有影響，這證實了在Kras和Trp53突變的情況下，HR缺陷和POLQ失活之間有強烈的合成致死關系。與KPC-Brca2-/-細胞一樣，攜帶Brca1突變的KPC細胞在使用shPOLQ時也顯示出菌落形成的減少。重要的是，雖然有報道稱ATM突變的腫瘤對PARP抑制相對不敏感，但POLQ敲除也在Atm缺陷的KPC細胞中表現(xiàn)出明顯的效果。

由于細胞在HRD的情況下依賴POLQ介導的DNA修復，接下來分析了γH2AX病灶的形成，作為累積DNA損傷的生物標記。POLQ敲除增加了KPC-Brca2-/-細胞的γH2AX病灶，而KPC細胞的γH2AX病灶水平在shCtrl和shPOLQ之間沒有明顯差異（圖2，B和C）。對KPC和KPC-Brca2-/-腫瘤細胞進行了Rad51病灶形成試驗，無論是未經(jīng)處理的還是對10Gy電離輻射（IR）的反應。在沒有IR的情況下，KPC和KPC-Brca2-/-腫瘤之間沒有觀察到Rad51病灶形成的明顯差異，而shRNA介導的POLQ抑制導致KPC-Brca2-/-細胞的Rad51病灶形成有小幅但明顯的上升，但KPC細胞沒有。在KPC小鼠中觀察到Rad51病灶的形成有更大的增加，在shRNA介導的POLQ抑制下進一步增強。然而，在IR誘導的DNA損傷下，KPC-Brca2-/-細胞的Rad51病灶形成比KPC細胞低得多，這些細胞在shRNA介導的POLQ抑制下沒有明顯差異。這些數(shù)據(jù)表明，KPC-Brca2-/-細胞所表現(xiàn)出的體外生長減少，至少有一部分是由于DNA修復機制的錯誤。進一步測試了有無POLQ抑制的ATM缺陷的KC細胞系中Rad51病灶的形成，以檢查Rad51的活性是否只依賴于Brca2或其他DDR基因。IR明顯增加了KPC和KC-ATM-/-細胞中Rad51病灶的形成。抑制POLQ并不影響KC-Atm-/-細胞中Rad51病灶的形成，無論是否有IR處理，這表明Brca2對Rad51病灶的形成是必需的。此外，我們在KPC和KPC-Brca2-/-細胞中進行了復制蛋白A（RPA）病灶形成試驗。在未受輻射的KPC和KPC-Brca2-/-細胞中，RPA病灶的形成非常低，而且POLQ的抑制沒有影響。給予IR后，KPC細胞的RPA形成明顯增加，這不受Brca2缺失和POLQ敲除的影響。

為了評估POLQ敲除的這些觀察效果是否在人類模型中看到，將shPOLQ1和2轉(zhuǎn)染到具有各種DDR基因突變的人類PDAC衍生的細胞系。觀察到shPOLQ1和2在BRCA2S1982fs（BRCA2Mut）細胞系X337中的集落形成減少，而shPOLQ對WT BRCA2（BRCA2WT）細胞系NYU318沒有明顯影響（圖2D）。同樣，shPOLQ減少了NYU228（一種具有致病性ATMR3008H突變（ATMMut）的細胞系）的集落形成，但在ATM-WT（ATMWT）MIAPaCa-2細胞中卻沒有。還研究了γH2AX病灶作為人類PDAC細胞系累積DNA損傷的生物標記。POLQ敲除增加了X337-BRCA2Mut細胞的γH2AX灶，而NYU318-BRCA2WT細胞的γH2AX灶水平在shCtrl和shPOLQ之間沒有明顯差異（圖2，E和F）。

2.POLQ抑制劑的在HR缺陷的PDAC模型中的效果

在所有不同的基因敲除KPC系中進行ART558處理（圖3A），以檢查細胞活力對POLQ的藥理抑制的反應。ART558對KPC-Brca2-/-細胞最有效（IC50 9.6 μM），與KPC細胞（IC50 53.2 μM）相比，在KPC-Brca1-/-細胞（IC50 37 μM）和KC-Atm-/-細胞（IC50 30.6 μM）也有明顯效果。與NYU318-BRCA2WT細胞相比，ART558還明顯改變了X337-BRCA2Mut、NYU341-BRCA2Mut、X114-BRCA2Mut和Capan1-BRCA2Mut人PDAC細胞的劑量反應曲線（圖3B）。值得注意的是，與小鼠Brca2缺陷的PDAC細胞系相比，人的細胞死亡的IC50值更高。與NYU521-BRCA2WT PDAC器官相比，在人NYU341-BRCA2Mut和NYU358-BRCA2Mut PDAC器官中觀察到類似的ART558的細胞存活率下降（圖3，C和D）。為了進一步驗證ART588是否會影響ATM缺陷環(huán)境下的細胞活力，利用MiaPaCa2 PDAC細胞以及其同源的對應細胞進行了ATM基因的敲除工程。與ATMWT MiaPaCa2細胞相比，在ATM-/-MiaPaCa2-ATM細胞中，ART558處理的細胞活力有統(tǒng)計學意義的下降。

測試了抗生素novobiocin，它在一個篩選中被確定為特異性POLQi。與KPC細胞相比，NVB在KPC-Brca2-/-和KPC-Brca1-/-細胞中表現(xiàn)出適度但明顯的生存能力下降（圖3E）。低通量的人類PDAC細胞系X337-BRCA2Mut、NYU341-BRCA2Mut和X114-BRCA2Mut對NVB的劑量反應曲線沒有明顯差異，但NYU318-BRCA2WT細胞有差異（圖3F）。同時，我們驗證了Capan1-BRCA2Mut，一個以前被報道對NVB有反應的PDAC細胞系，與BRCA WT對照組相比，對NVB的細胞存活率下降。

3.靶向POLQ抑制BRCA突變腫瘤生長

為了研究POLQ的穩(wěn)定敲除是否會抑制HR缺陷的胰腺腫瘤在體內(nèi)的生長，我們將KPC和KPC-Brca2-/-細胞的POLQ敲除后植入到同基因C57BL/6J小鼠的胰腺中。植入28天后，KPC-Brca2-/- shPOLQ腫瘤的生長速度明顯減慢，與KPC-Brca2-/- shCtrl組相比小得多（腫瘤體積213±19 mm3對633±38 mm3，P＜0.001），而POLQ敲除并不影響KPC腫瘤的大?。▓D2，G-I）。KPC-Brca2-/-突變體腫瘤中的POLQ敲除導致增殖減少，如Ki67表達所衡量，并增加凋亡，如Caspase 3 [CC3]表達所衡量。總的來說，這些數(shù)據(jù)支持POLQ在體內(nèi)HR缺陷的PDAC細胞中的合成致死功能。

3.靶向抑制POLQ激活cGAS-Sting信號通路

微核（MN）是在基因組不穩(wěn)定的情況下產(chǎn)生的，當未修復的DNA片段從細胞核轉(zhuǎn)移到細胞質(zhì)，激活了cGAS-STING途徑。已經(jīng)觀察到POLQ的抑制增加了用DNA破壞劑處理的細胞或具有DDR缺陷的突變（如FANCD2和BRCA1）的微核的形成。因此，通過微核計數(shù)和cGAS染色評估來研究POLQ敲除如何影響體外PDAC模型中微核的形成，因為cGAS會在微核中積累。發(fā)現(xiàn)，與KPC Ctrl細胞相比，KPC-Brca2-/- shCtrl細胞的微核形成的基礎水平有小幅但統(tǒng)計學意義的增加（圖4，A和B），其中微核的主要部分表達cGAS。敲除POLQ導致KPC-Brca2-/-細胞中表達cGAS的微核數(shù)量進一步增加，這一發(fā)現(xiàn)在WT KPC細胞中沒有觀察到（圖4，A和B）。在KPC-Brca1-/-和KC-Atm-/-細胞中也觀察到類似的效果。由于已知cGAS參與了STING途徑的激活，通過研究STING的下游效應物來評估POLQ在STING信號傳導中的作用。TBK1在STING激活時被磷酸化，并導致轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）的后續(xù)磷酸化，從而誘發(fā)I型干擾素反應。免疫熒光分析顯示，在KPC-Brca2-/-細胞中，POLQ敲除后p-TBK1水平升高，但在KPC細胞中沒有（圖4，C和D）。用ART558對POLQ的藥理抑制反映了POLQ敲除在這些細胞系中微核形成和p-TBK水平的結(jié)果。與KPC-Brca2-/-細胞一樣，人類PDAC X337-BRCA2Mut shCtrl細胞的微核和cGAS表達水平都明顯高于NYU318-BRCA2WT shCtrl細胞（圖4，E和F）。POLQ敲除進一步提高了X337-BRCA2Mut細胞中cGAS+微核的形成，而在NUY318 shPOLQ細胞中沒有觀察到這種影響。在cGAS-STING激活的下游，p-TBK1的表達隨著shPOLQ在X337-BRCA2Mut細胞中增加，但在NYU318-BRCA2WT細胞中沒有增加（圖4G）。在POLQ抑制的情況下，在KPC-Brca2-/-細胞上加入OLA，可明顯提高cGAS+MN+細胞和p-TBK+細胞的比例。

4.靶向抑制POLQ選擇性激活細胞中炎癥因子表達

cGAS-STING途徑在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中的作用已經(jīng)引起了極大的興趣。癌細胞細胞質(zhì)中異常DNA的積累可以導致STING的激活，從而誘導I型干擾素的表達，而I型干擾素在先天和適應性免疫細胞的激活中起著關鍵作用。最近，已經(jīng)證明PDAC中STING的激活刺激了體內(nèi)炎癥性趨化因子和細胞因子的表達，并導致活化的、具有細胞毒性的CD8+T細胞數(shù)量增加，以及TAMs從M2表型到M1表型的重新編程。因此，評估了POLQ的抑制，及其對cGAS-STING信號的影響，如何影響腫瘤免疫反應。首先，進行了體外細胞因子陣列，以確定以前被證明是由STING激活上調(diào)的細胞因子的表達。雖然shPOLQ沒有改變KPC細胞中IFNγ、CXCL10、CCL5和CXCL9的水平，但與shCtrl相比，表達shPOLQ的KPC-Brca2-/-細胞中這些細胞因子/化合因子明顯升高。同樣，X337-BRCA2Mut細胞在shPOLQ的作用下，IFNγ、CXCL10、CCL5和CXCL9的表達明顯升高，而shPOLQ對NYU318-BRCA2WT細胞的細胞因子水平影響很小。此外，證明在KPC-Brca2-/-細胞中，對POLQ敲除和PARPi ola的反應是IFNγ和CXCL10的上調(diào)，并且POLQ敲除和PARP抑制的效果是相加的。

在BRCA2缺陷的PDAC中，POLQ抑制改變了免疫格局，增加了活化的CD8+T細胞的浸潤。利用KPC和KPC-Brca2-/ shCtrl和shPOLQ細胞的體內(nèi)正位模型，研究了這些發(fā)現(xiàn)如何轉(zhuǎn)化為POLQ在適應性免疫反應中的作用，特別是考慮到STING的激活以前被證明會影響免疫細胞的浸潤。腫瘤生長4周后收獲，通過流式細胞儀和IHC染色進行免疫分析。Brca2缺陷的腫瘤在POLQ的抑制下，CD4+和CD8+T細胞的涌入明顯增多，而shPOLQ對WT Brca2腫瘤的瘤內(nèi)CD4+和CD8+T細胞群沒有明顯影響（圖5，A-D）。為了評估腫瘤微環(huán)境中浸潤的CD8+T細胞的激活狀態(tài)，對腫瘤切片進行了CD8和顆粒酶B的聯(lián)合免疫熒光分析，后者是指示激活的CD8+T細胞的標記物。如圖5，E-G所示，CD8+T細胞和CD8+顆粒酶B+T細胞的百分比隨著POLQ敲除而增加，表明在這種情況下腫瘤微環(huán)境中T細胞效應功能增加。值得注意的是，除了T細胞種群的變化，KPC-Brca2-/-shPOLQ腫瘤中的腫瘤相關巨噬細胞（TAMs）比shCtrl腫瘤少（圖5H）。進一步分析，shPOLQ的TAMs的減少是由于免疫抑制性TAMs的明顯減少，而不是具有免疫激活表型的TAMs的差異（圖5，I和J）。

5.POLQ抑制依賴STING激活誘導抗腫瘤作用