今天瑞禧生物小編要給大家整理分享的是CD63-EGFP標記外泌體/外泌體包裹重組外源蛋白/跨膜蛋白3包裝外泌體的制備，一起來看！

肝竇內皮細胞（LSEC)是肝常駐抗原提呈細胞，可攝取門靜脈血中的抗原物質，誘導肝乃至全身的特異性免疫耐受。具有刺激免疫應答和誘導免疫耐受的雙重作用。由于外泌體尺寸很小，以往研究缺少用成像的方法直接觀察外泌體與LSEC的相互作用。

通過免疫磁珠分選LSEC，密度梯度離心純化CT26.WT細胞培養(yǎng)液來源的外泌體，熒光染料DiI標記后，采用CLSM直接觀察LSEC 在體外對外泌體的攝取。應用基因工程方法構建CT26-DsRed/EGFP-Exo轉基因細胞，建立CT26-DsRed/EGFP-Exo小鼠結腸原位荷瘤模型，應用CLSM“可視化”研究在體內環(huán)境下LSEC對外泌體的攝取。

結果

經anti-CD146免疫磁珠分選出的LSEC 在掃描電鏡下具特征性“窗孔”結構，F(xiàn)CM檢測顯示CD146+ LSEC中超過80%的細胞為VWF陽性。LSEC貼壁后，呈特征性鋪路石樣外觀。用超速離心法分離出的CT26.WT細胞培養(yǎng)液來源的外泌體，透射電鏡下表現(xiàn)為具有雙層膜結構的囊泡，直徑在30~100nm之間，Western blot和免疫膠體金檢測均證實其富含外泌體的標志蛋白CD63。熒光染料DiI能夠標記外泌體，命名為Exo-DiI。在LSEC培養(yǎng)體系中加人Exo-Dil，CLSM下可見LSEC胞質內很快出現(xiàn)Exo-DiI，呈紅色點狀熒光，說明LSEC 在體外可快速攝取外泌體。經小鼠尾靜脈注射Exo-DiIl后，制備肝臟冰凍切片，CLSM下可見anti-VWFFTTC標記的LSEC同Exo-DiI位于肝血竇內相同區(qū)域,說明LSEC可快速攝取肝血竇中的外泌體。利用anti-CD146免疫磁珠分離純化LSEC，經anti-vWF-FITC染色后置CLSM下觀察，可見LSEC中攝取有Exo-DiI，進一步證實LSEC能夠快速攝取流經肝血竇的外泌體。

CT26-DsRed/EGFP-Exo轉基因細胞在CLSM下，紅色熒光蛋白DsRed將細胞整體標記為紅色，CD63-EGFP將多泡體標記為綠色，在融合圖像上呈黃色點狀。建立CT26-DsRed/EGFP-Exo小鼠結腸原位荷瘤模型，取組織冰凍切片，CLSM下可見紅色的實質內存在CD63-EGFP標記的多泡體，而無熒光標記的間質中也存在CD63-EGFP標記的外泌體，說明實質向周圍環(huán)境釋放外泌體。模型鼠門脈血涂片可檢測到血液中有綠色的EGFP-Exo外泌體存在。模型鼠肝臟冰凍切片可見肝竇部位存在綠色的EGFP-Exo外泌體，說明結腸組織釋放的EGFP-Exo外泌體循門脈血回流至肝臟，被肝臟中包括LSEC在內的吞噬細胞所攝取。進一步應用anti-CD146免疫磁珠自模型鼠分選出LSEC，置CLSM下觀察，可見分離純化的CD146* LSEC細胞攝取了CT26-DsRed/EGFP-Exo組織來源的EGFP-Exo外泌體。

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