1??實驗前準備

實驗開始前，將無菌培養(yǎng)瓶，15mL離心管、移液管、移液槍、槍頭等放入無菌超凈工作臺，以紫外線照射 30min。然后，采用通風機通風 3min。以 75%酒精擦拭操作臺和雙手。準備好冰盒。將離心機調節(jié)至 800rpm，5min。水浴箱調節(jié)至 37 度恒溫。取細胞完全培養(yǎng)基，放于水浴箱中預熱。消毒雙手和超凈臺。取約 10mL細胞完全培養(yǎng)基放于 15mL離心管中。實驗前備冰盒，快速由液氮中取出凍存的細胞，置于冰盒內。然后迅速將凍存管投入到已經預熱到 37 度的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動，使管中的液體迅速融化，注意管口處高于水面，以免進入導致污染。整個解凍過程最好在 1 min以內，以防融化過程中產生大量冰晶損傷細胞，約 1min 后凍存管內液體完全溶解，取出用酒精噴拭凍存管的外壁，立即拿入超凈臺內。

2??制備細胞懸液

以無菌槍頭吸取細胞凍存液，置于已放入細胞完全培養(yǎng)基的離心管中，上下吹打 5 次，使凍存液與完全培養(yǎng)基充分混勻，盡量減少凍存液中 DMSO 的濃度，減輕細胞損傷。以封口膜封好管口。配平離心：采用天平配平兩端，800rpm，室溫離心 5min。

3??細胞計數

采用羅氏 CASY-DT 快速細胞計數及活率分析儀進行細胞計數。加入 10mLCASY-ton 至以標記 viable 的管子中，加入 100uL細胞懸液，顛倒混勻3次，可進行細胞計數?？梢娒亢辽龖乙褐杏谢罴毎?2 乘 10 的 5 次方。

4??細胞培養(yǎng)

離心后，吸棄上清液，不要吸到底部的細胞沉淀。根據計數結果，向離心管內的細胞沉淀加入 10mL細胞完全培養(yǎng)基，反復吹打制成細胞懸液，吹打過程中盡量不要產生氣泡。符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶內，左右輕輕搖動培養(yǎng)瓶，把細胞搖均勻，將培養(yǎng)瓶放入 37℃，5％CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 2-4 h或者 24-48 h后換液繼續(xù)培養(yǎng)，換液的時間由細胞情況而定，一般以大部分細胞狀態(tài)良好時換液為宜，比如超過半數的細胞貼壁，即可換液。