前言

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤之一。新輔助化療（NAC）和根治性膀胱切除術(shù)（RC）是肌肉浸潤性膀胱癌（MIBC）的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，但由于具預(yù)后不良從而導(dǎo)致治療效果不佳。最近研究表明，新輔助免疫及聯(lián)合治療不僅能改善膀胱癌預(yù)后，且利于保膀胱治療的實(shí)施從而提高患者生活質(zhì)量。但目前，由于對MIBC患者治療的3種方式——新輔助化療、新輔助免疫治療（NICB）、新輔助免疫聯(lián)合化療（NAC.NICB）還沒有正面的對比研究，以及聯(lián)合治療在不能切除或轉(zhuǎn)移性的MIBC患者中作用的不確定性，再加上NICB治療療效缺乏可靠的生物標(biāo)志物等因素。該研究通過平行比較NAC、NICB和NAC.NICB三者治療的療效及安全性，開發(fā)療效預(yù)測模型，并通過單細(xì)胞測序來探索了膀胱癌免疫治療耐藥機(jī)制。

2022年10月12日，湘雅醫(yī)院泌尿外科祖雄兵主任團(tuán)隊(duì)領(lǐng)銜的膀胱癌新輔助治療多中心協(xié)作組臨床研究成果發(fā)表于《Cell》子刊《Cell Reports Medicine》（IF:16.988），以原創(chuàng)性論著形式在線發(fā)表題為“Neoadjuvant immunotherapy, chemotherapy, and combination therapy in muscle-invasive bladder cancer: A multi-center real-world retrospective study”的膀胱癌新輔助治療原創(chuàng)性成果。

期刊：Cell Reports Medicine

影響因子：16.988

發(fā)表年月：2022.10.12

材料：3個(gè)人膀胱癌樣本

方法：10×Genomics scRNA-seq

研究結(jié)果

Result 1 評價(jià)三種新輔助治療的療效和安全性

新輔助治療分組如圖1所示。包括兩個(gè)階段的患者，共計(jì)253名患者：發(fā)現(xiàn)階段（NAC.NICB=30; NAC:53; NICB:21）和驗(yàn)證階段（NAC.NICB=68; NAC:54; NICB:27）。

隨后，在現(xiàn)實(shí)環(huán)境中評價(jià)三種新輔助治療的療效和安全性。對所有253名患者進(jìn)行病理分期評估和療效結(jié)果總結(jié)（表1）。結(jié)果顯示，50名患者（19.8%）表示得到完全響應(yīng)，72名患者（28.5%）表示得到部分響應(yīng)?？傮w病理下降率和疾病控制率分別為48.2%和87.7%。31名患者（12.3%）出現(xiàn)進(jìn)展性疾病。其中，NAC.NICB列隊(duì)的完全響應(yīng)率顯著高于其余兩列隊(duì)，同樣，NAC.NICB列隊(duì)的病理學(xué)下降率顯著高于其余兩列隊(duì)。

圖1 |?患者選擇流程

表1?|?三種新佐劑方案的病理反應(yīng)

Result 2 臨床病理特征與病理反應(yīng)的關(guān)系

在這里，由于NAC.NICB列隊(duì)具有最高的完全響應(yīng)率和病理反應(yīng)率，因此作者通過關(guān)注NAC.NICB列隊(duì)篩選生物標(biāo)志物來預(yù)測治療反應(yīng)。通過對共有的28名患者在發(fā)現(xiàn)階段有足明顯的臨床病理特征進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)較低的臨床階段（p=0.018），尿路上皮癌組織學(xué)（p=0.016）、較高血紅蛋白（p=0.019）、較低血小板（p=0.044）、較低球蛋白（p=0.034）和較低淋巴細(xì)胞的比值（p=0.016）都與較高病理反應(yīng)率有顯著相關(guān)。

表2 |?發(fā)現(xiàn)階段NAC.NICB隊(duì)列病理反應(yīng)相關(guān)因素的單變量分析

Result 3 基于NAC.NICB中純預(yù)處理臨床特征的病理反應(yīng)預(yù)測模型的開發(fā)和驗(yàn)證

先前發(fā)現(xiàn)5種純預(yù)處理臨床特征，包括臨床分期和4種血液學(xué)特征，與病理反應(yīng)顯著相關(guān)。接著，作者通過擬合模型，發(fā)現(xiàn)四種血液學(xué)特征之間存在明顯的線性關(guān)系（圖2A）。根據(jù)這四項(xiàng)指標(biāo)與病理反應(yīng)的關(guān)系，將其整合到新的指標(biāo)中，并定義為PLR.GHR（PLR*球蛋白/血紅蛋白）。結(jié)果顯示，非應(yīng)答者的PLR.GHR顯著高于應(yīng)答者（圖2B），且PLR.GHR相較于其他四個(gè)指標(biāo)具有更高的病理反應(yīng)預(yù)測的準(zhǔn)確度（圖2C）。隨后，作者將臨床分期和PLR.GHR合并轉(zhuǎn)化為線性回歸模型，建立病理反應(yīng)預(yù)測列線圖（圖2D），計(jì)算所有患者的反應(yīng)得分。結(jié)果顯示，列線圖的引導(dǎo)AUC為0.95時(shí)，高于臨床階段（AUC=0.77）和PLR.GHR（AUC=0.80）(圖2F），校準(zhǔn)曲線和決策曲線分析充分的驗(yàn)證了列線圖的統(tǒng)計(jì)性能及準(zhǔn)確性（圖2J-K）。

圖2 | 在NAC.NICB中開發(fā)和驗(yàn)證病理反應(yīng)預(yù)測列線圖

Result 4 單細(xì)胞測序探究NICB中潛在的生物標(biāo)記物

為了進(jìn)一步挖掘NICB的有效生物標(biāo)記物，通過對來自NICB隊(duì)列的兩個(gè)反應(yīng)樣品和一個(gè)抗性樣品進(jìn)行了scRNA-seq。結(jié)果顯示，共檢測到有16，298個(gè)單細(xì)胞被分類為17個(gè)簇（圖3）。這些簇進(jìn)一步定義為七種細(xì)胞類型，包括膀胱癌上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞，T / NK細(xì)胞，骨髓細(xì)胞，B細(xì)胞，成纖維細(xì)胞等。其中，癌細(xì)胞和T/NK細(xì)胞在反應(yīng)組和抗性組之間細(xì)胞比例的差異較大（圖3L-M），所以癌細(xì)胞和T/NK細(xì)胞可能是膀胱癌中NICB反應(yīng)的決定因素。因此，作者將T / NK細(xì)胞進(jìn)一步分為三個(gè)亞組，包括CD8 T細(xì)胞，CD4 T細(xì)胞和NK細(xì)胞（圖4A-J）。NICB抗性組的T / NK細(xì)胞數(shù)量小于NICB反應(yīng)組的數(shù)量（圖4K）。特別是， NICB組中CD8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例較低（圖4L），突出了CD8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞對NICB響應(yīng)的關(guān)鍵作用。

圖3 | 識別細(xì)胞類型并比較反應(yīng)組和抗性組之間細(xì)胞比例的差異

圖4 | NICB隊(duì)列中T／NK細(xì)胞的重新聚集

為了探究膀胱癌細(xì)胞的異質(zhì)性，作者由進(jìn)一步將它們分為五個(gè)亞型，并探究了其基因表達(dá)功能。結(jié)果顯示，subcluster 0的功能主要在中性粒細(xì)胞相關(guān)途徑中富集，subcluster 1的功能在RNA分解代謝相關(guān)途徑中富集（圖5C），subcluster 2和subcluster 3的功能在RNA剪接相關(guān)途徑中富集（圖5D和5E），subcluster 4的功能在細(xì)胞周期相關(guān)途徑中富集。因此，作者根據(jù)功能不同將5個(gè)subcluster進(jìn)一步劃分為4個(gè)subcluster并進(jìn)行了定義, 包括中性粒細(xì)胞亞型，RNA分解代謝亞型，RNA剪接亞型和細(xì)胞周期亞型。其中，細(xì)胞周期亞型是NICB反應(yīng)組中唯一的細(xì)胞亞型（圖5H），說明subcluster 4具有特殊的異質(zhì)性，可能是一種特殊的癌細(xì)胞。此外，作者也證明了幾個(gè)關(guān)鍵的免疫相關(guān)途徑，如抗原處理和呈遞、趨化因子相關(guān)途徑和T細(xì)胞相關(guān)途徑，在細(xì)胞周期亞型中顯著富集，這與先前的研究結(jié)果一致：細(xì)胞周期相關(guān)途徑的異常變化可能會增加腫瘤微環(huán)境中腫瘤突變負(fù)荷和新抗原的水平，從而增加腫瘤免疫原性和對免疫治療的敏感性?？傊?，在這里作者通過從scRNA-seq水平上確定了一組“細(xì)胞周期亞型”膀胱癌細(xì)胞，該亞型細(xì)胞是NICB療效的積極決定因素。

圖5 | 膀胱癌細(xì)胞亞群聚類

文章總結(jié)

本文作者通過在相同的實(shí)際臨床實(shí)踐環(huán)境中，比較了新輔助聯(lián)合療法（tislelizumab + GC）與單獨(dú)的新輔助化療和新輔助免疫治療，獲得了最高的完全響應(yīng)率和病理下降率。表明新輔助化學(xué)免疫療法可以安全地用于肌肉浸潤性膀胱癌患者，同時(shí)開發(fā)并驗(yàn)證了療效預(yù)測模型，以幫助確定接受新輔助化學(xué)免疫治療的候選者。作者通過單細(xì)胞測序技術(shù)來進(jìn)一步挖掘NICB的功效生物標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)CD8 T細(xì)胞和NK細(xì)胞對NICB響應(yīng)的關(guān)鍵作用。其中，“細(xì)胞周期亞型”膀胱癌細(xì)胞對NICB療效有著積極的影響。綜上，本文開發(fā)并驗(yàn)證了新輔助化學(xué)免疫療效預(yù)測模型，構(gòu)建了基于NICB治療單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜，為解析膀胱癌細(xì)胞的亞群及探究NICB中潛在的功效生物標(biāo)記物提供了寶貴經(jīng)驗(yàn)。

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