前面的推文詳細介紹了如何使用hisat2、stringtie和DEseq2完成轉(zhuǎn)錄組分析。但是，在實際使用這些軟件進行轉(zhuǎn)錄組分析的過程中常常會遇到一些問題，特別是當(dāng)讀者需用在學(xué)?；蛘吖镜膌inux上執(zhí)行相關(guān)的分析流程卻沒有root權(quán)限時，相關(guān)的問題會被無root權(quán)限無限的放大，因而，也更需要解讀本篇介紹的相關(guān)知識。接下來，我將在下面通過問答的方式記錄自己所遇到的問題或者所踩的坑，也可以給處于相同情況的數(shù)據(jù)分析者提供參考。

1?測序文件出現(xiàn)問題，質(zhì)控不通過

遇到這種問題，首先需要思考的就是找到原始文件。因為文件在windows和linux系統(tǒng)間傳輸時如果使用ASCII碼，特別容易出現(xiàn)問題，此時需要選用二進制文件傳輸方式。即使兩個文件的大小完全一致，也可能會出現(xiàn)上述質(zhì)檢不通過的情況。此時，最經(jīng)濟的措施就是重新上傳質(zhì)控過的文件（確保這個文件通過質(zhì)控），而不是找原因。

2?調(diào)用hisat2時出現(xiàn)‘/usr/bin/env: ‘python’: No such file or directory’報錯

系統(tǒng)中又有python3命令時，只需要將hisat2-build和hisat2文件（可執(zhí)行）的首行由‘!#/usr/bin/env python’替換成‘!#/usr/bin/env python3’即可。

3?編譯samtools時出現(xiàn)‘configure: error: zlib development files not found’報錯

遇到這種情況的原因是因為系統(tǒng)中不存在zlib或者已經(jīng)編譯好的zlib不在系統(tǒng)路徑中，那么這時該怎么辦呢？

首先，下載zlib包。

其次，解壓zlib包，并編譯通過。

再次，下載samtool。

最后，編譯samtool。

此時，需要注意的是，如果你的系統(tǒng)環(huán)境中缺乏curses?、bz2和lzma包，則編譯時系統(tǒng)會讓你添加‘--without-curses --disable-bz2 --disable-lzma’選項。在編譯中指定zlib的選項為‘CPPFLAGS=-I/home/nwq/wangjun/software/zlib-1.2.11/includeLDFLAGS=-L/home/nwq/wangjun/software/zlib-1.2.11/lib’

4?運行示例

前面的推文中分段介紹了各個軟件的使用，卻沒有一個完整的案例將這些軟件的使用串聯(lián)起來，這里就用偽代碼演示如何完成完整的轉(zhuǎn)錄組分析。

隨后，即可使用DEseq2進行差異表達分析（使用方法詳見這篇推文《轉(zhuǎn)錄組分析<四>之使用DEseq2/edgeR進行差異分析》）。

三 慣例小結(jié)

通過構(gòu)建索引、生成可變剪切文件，我們就可以獲得除測序文件外，所有應(yīng)該被準備好的數(shù)據(jù)了。那么，接下來，就輪到正式比對啦。

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另外，怎么說呢，投幣也可，不強求，但奢求。