熒光素酶-活體成像實(shí)驗(yàn)常見問題盤點(diǎn)～
熒光素酶（Luciferase）是自然界中能夠產(chǎn)生生物熒光的酶的統(tǒng)稱，其中最有代表性的是來自北美螢火蟲體內(nèi)的熒光素酶(Firefly?Luciferase)。螢火蟲熒光素酶屬于加氧酶，其發(fā)光反應(yīng)需要O2和Mg2+參與；有輔酶A存在時(shí)能提高反應(yīng)效率，增加發(fā)光時(shí)間。螢火蟲熒光素酶無(wú)需翻譯后修飾，即可表現(xiàn)出熒光素酶活性。
活體成像技術(shù)原理：
將熒光素酶編碼序列通過遞送工具遞送至目的細(xì)胞或組織內(nèi)表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予相應(yīng)底物，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會(huì)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。
底物給藥方式及特點(diǎn)：
常用的底物給藥方式有腹腔注射和尾靜脈注射。
腹腔注射（常用）：迅速分布全身，并穿過包括大腦在內(nèi)的血液組織屏障；注射底物 10～20 分鐘后，發(fā)光信號(hào)達(dá)到峰值；
尾靜脈注射：可提供更好的再現(xiàn)性和 5～10 倍的高信號(hào)，但是注射難度較高，代謝快。
建議：第一次使用熒光素酶底物成像，或者更換新品牌底物，需要進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察底物在何時(shí)達(dá)到峰值。確定注射熒光素底物和成像之間的最佳延遲，然后將此時(shí)間用于所有實(shí)驗(yàn)，以標(biāo)準(zhǔn)化成像數(shù)據(jù)。
常見問題
Q：熒光素酶的發(fā)光是否需要激發(fā)光？
A：熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素（Luciferin）。
Q：底物熒光素（Luciferin）是如何進(jìn)入小鼠體內(nèi)的？需要多少？
A：熒光素一般通過腹腔注射或尾部靜脈注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)的。常用方法是腹腔注射，擴(kuò)散較慢，開始發(fā)光慢，持續(xù)發(fā)光長(zhǎng)。若進(jìn)行熒光素靜脈注射，擴(kuò)散快，開始發(fā)光快，但發(fā)光持續(xù)時(shí)間很短。大部分文獻(xiàn)中，熒光素的濃度是150mg/kg。20g的小鼠約需3mg的熒光素（具體可參考相應(yīng)文獻(xiàn)）。
Q：熒光素酶的發(fā)光特性如何？
A：通過腹腔注射老鼠后約一分鐘左右熒光素酶就開始發(fā)光，通常十分鐘后強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定的最高點(diǎn)。在最高點(diǎn)通常持續(xù)約20-30分鐘后開始衰減，約三小時(shí)后發(fā)光全部消失。通常最好的檢測(cè)時(shí)間是在注射后15 - 35分鐘之間，建議實(shí)驗(yàn)人員在做不同實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ颓斑M(jìn)行連續(xù)時(shí)間點(diǎn)發(fā)光曲線的繪制，以確定最高穩(wěn)值的時(shí)間范圍。
Q：有幾種常用的熒光素酶？特性如何？
A：常用的熒光素酶有兩種，分別是Luciferase和Renilla熒光素酶，二者的底物不一樣，前者的底物是D-luciferin，后者的底物是coelentarizine。二者的發(fā)光顏色不一樣，前者所發(fā)的光波長(zhǎng)在540-600nm，后者所發(fā)的光波長(zhǎng)在460-540nm左右。前者所發(fā)的光更容易透過組織，后者在體內(nèi)的代謝比前者快。
Q：正常成年小鼠可以看到體內(nèi)發(fā)光嗎？是否需要裸鼠？
A：可以。成體老鼠和裸鼠，幼鼠及胚胎的區(qū)別只在于對(duì)可見光的穿透性不同。
Q：熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度是否同細(xì)胞的數(shù)量成正比？
A：是的，熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度同標(biāo)記的靶點(diǎn)，包括細(xì)胞、基因、細(xì)菌和病毒的數(shù)量成正比。有文獻(xiàn)顯示熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與細(xì)胞數(shù)成正比關(guān)系，并且線性關(guān)系到0.9 以上。
Q:動(dòng)物的皮膚和毛發(fā)是否會(huì)影響收集光信號(hào)的強(qiáng)弱？
A:會(huì)有一定的影響。例如，C57BL/6 小鼠毛發(fā)生長(zhǎng)周期由三個(gè)階段組成：靜止期（皮膚為淡粉色）、生長(zhǎng)期（皮膚變?yōu)樯罨疑蚝谏?、成熟期（毛發(fā)停止生長(zhǎng)，皮膚恢復(fù)為淡粉色）。生長(zhǎng)期中的皮膚色素沉著是活體成像中的一個(gè)重要變量，特別是當(dāng)需要對(duì)小信號(hào)變化或動(dòng)物之間的信號(hào)差異進(jìn)行評(píng)估時(shí)，強(qiáng)烈著色的皮膚可導(dǎo)致 90% 以上的光信號(hào)衰減，這是可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差的因素之一。此外，就算是處于靜止期或成熟期的小鼠，身上的毛發(fā)也會(huì)造成一個(gè)數(shù)量級(jí)的光信號(hào)衰減。建議：成像前一天，需要通過剃毛或化學(xué)脫毛來去除觀察區(qū)域的毛發(fā)，以便最大限度地收集信號(hào)。
