腫瘤組織是由正常細胞和腫瘤細胞組成的復(fù)雜組織，在以往基因組或轉(zhuǎn)錄組的研究中，很難對其中各種細胞間關(guān)系和組織微環(huán)境進行系統(tǒng)全面的解釋。那么，如何將其與單細胞技術(shù)結(jié)合，根據(jù)單細胞水平的基因表達情況對每一個細胞進行精確分類呢？

在單細胞測序中，對腫瘤組織細胞進行分類的方法通?；?strong>無監(jiān)督聚類分析，根據(jù)已知Marker基因的表達對細胞類型進行判定，以及基于拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)從單細胞的表達數(shù)據(jù)推斷細胞類型。前者基于聚類分析的方法可能受到多種因素影響，包括聚類算法、用于注釋的Marker基因選擇等，準確判定需要結(jié)合大量過往生物學(xué)知識；而后者基于cnv的方法則需要進行大量密集型計算，相對耗時。

因此，Mariano Alvarez 團隊提出了一種名為基因組不穩(wěn)定性分析(genomic instability Analysis, GIA)的新方法，運行速度相比inferCNV快至少5~6倍，能夠快速評估單個細胞內(nèi)的基因組變化情況，輔助腫瘤細胞的判定。

Genomic Instability原理

該軟件使用aREA算法，對單細胞基因表達譜中的連續(xù)編碼基因(位點塊)進行富集分析，從而定量估計出基因表達與染色體位置之間的關(guān)聯(lián)性（inferCNV）。

genomicInstability軟件主要整合了三大功能函數(shù)：

①inferCNV：量化表達譜與位點塊之間的關(guān)聯(lián)函數(shù)；

②genomicInstabilityScore：估計每個細胞的基因組不穩(wěn)定性評分；

③giLikelihood：估計每個細胞基因組不穩(wěn)定的可能性。

基因組不穩(wěn)定性分析

2.1 不穩(wěn)定性打分和高斯建模

首先根據(jù)物種信息（人/小鼠），對表達數(shù)據(jù)的基因和蛋白ID進行匹配，得到與數(shù)據(jù)庫基因位點塊對應(yīng)的表達數(shù)據(jù)，從而進行關(guān)聯(lián)性分析。軟件用歸一化富集分數(shù)（NES）表示每個細胞在每個位點塊的富集程度，該位點塊富集到的基因表達范圍越廣，NES離散度越大，該區(qū)域的基因組不穩(wěn)定性也越高。接著根據(jù)富集分數(shù)計算基因組不穩(wěn)定性評分（GIS），并對整體細胞建立多個高斯模型。最后，根據(jù)GIS由高斯模型確定細胞基因組不穩(wěn)定概率（gi_likelihood_score）。

表1 不同細胞基因組不穩(wěn)定性評分示

從表1可以看出，control組較case組的細胞基因組不穩(wěn)定概率更低，可以較明顯的區(qū)分開腫瘤和非腫瘤細胞。

2.2 模型可視化和CNV熱圖

分析過程中會默認建立三個高斯模型，在不同高斯模型中，具有最低GIS均值的細胞被定義為基因組穩(wěn)定細胞，其他模型則代表基因組不穩(wěn)定細胞（即腫瘤細胞）。由圖1可以看出，灰色/藍色模型中更多的是GIS在-1 ~1.5 的非腫瘤細胞，而腫瘤細胞主要集中在右側(cè)GIS大于1.5的橙色模型中。

圖1 基因組不穩(wěn)定性評分分布以及高斯模型示例

根據(jù)基因組不穩(wěn)定性評分（GIS）和不穩(wěn)定概率，可以繪制染色體水平熱圖和featureplot，從而更直觀地看出基因組、各clusters細胞的不穩(wěn)定情況。圖2熱圖中，紅色表示位點塊區(qū)域存在擴增，藍色則表示存在缺失或刪除，其中Unstable表示細胞gi_likelihood_score 大于0.8， Stable 小于0.2。

圖2 染色體水平的位點塊富集熱圖示例

圖3 featureplot圖中，紅色區(qū)域表示細胞有較高的不穩(wěn)定性，可以看出右側(cè)一小簇細胞有更高的不穩(wěn)定性。

圖3 基因組不穩(wěn)定性featureplot可視化示例

genomicInstability軟件能夠根據(jù)單細胞基因表達數(shù)據(jù)，快速預(yù)估每個細胞是腫瘤細胞或正常細胞的概率，為腫瘤細胞的判定提供參考。

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