動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)寶典｜學(xué)習(xí)記憶系列之水迷宮實(shí)驗(yàn)方法
一、學(xué)習(xí)與記憶
學(xué)習(xí)是高等生物接受外界環(huán)境變化獲得新行為和經(jīng)驗(yàn)的過(guò)程，常見的學(xué)習(xí)形式有非聯(lián)合型學(xué)習(xí)和聯(lián)合型學(xué)習(xí)兩種。人或動(dòng)物受到一次或多次單一刺激后形成的、并不需要將兩個(gè)以上刺激或刺激與反應(yīng)之間形成明確聯(lián)系的過(guò)程，如習(xí)慣化（習(xí)以為常），稱為非聯(lián)合型學(xué)習(xí)；人或動(dòng)物受到一系列事物刺激、且在時(shí)間上很靠近地重復(fù)發(fā)生,最后在腦內(nèi)逐漸形成聯(lián)系，如操作性條件反射，稱為聯(lián)合型學(xué)習(xí)。
記憶是對(duì)學(xué)習(xí)獲得的經(jīng)驗(yàn)或行為的保持，包括獲得、鞏固、再現(xiàn)及再鞏固四個(gè)環(huán)節(jié)，常見的有程序性記憶與陳述性記憶。程序性記憶即無(wú)意識(shí)情況下建立的無(wú)法用語(yǔ)言描述的記憶，如使用筷子；陳述性記憶指可以用語(yǔ)言描述的關(guān)于過(guò)去經(jīng)歷或事件的記憶，包括事實(shí)、事件、情景以及他們間的相互關(guān)系等，如回憶并說(shuō)出事情經(jīng)過(guò)。
學(xué)習(xí)與記憶二者是互相聯(lián)系的神經(jīng)活動(dòng)過(guò)程，學(xué)習(xí)過(guò)程中必然包含記憶，記憶也總是需要以學(xué)習(xí)為先決條件。以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為對(duì)象，采集并分析動(dòng)物的行為信息是學(xué)習(xí)與記憶的常規(guī)研究手段之一。例如：利用動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)特性進(jìn)行研究、通過(guò)獎(jiǎng)懲等操縱進(jìn)行研究等。今天我們主要介紹利用動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)進(jìn)行研究的最常用手段之一：Morris水迷宮中的平臺(tái)探查實(shí)驗(yàn)研究方法（常規(guī)的水迷宮實(shí)驗(yàn)包括Morris水迷宮、通道式水迷宮等，由于Morris水迷宮最常用，本文主要介紹Morris水迷宮）。后續(xù)我們還會(huì)介紹：T/Y迷宮、放射性迷宮（八臂迷宮）、物體識(shí)別（新物體識(shí)別、位置物體識(shí)別）、操作性條件反射（斯金納箱）、穿梭箱、跳臺(tái)、避暗箱、巴恩斯迷宮等。
二、實(shí)驗(yàn)方法步驟
2.1 原理
1981年，Morris基于動(dòng)物厭惡水環(huán)境的特性建立了水迷宮方法，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被迫游泳，學(xué)習(xí)尋找隱藏在水中的平臺(tái)。通過(guò)記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在目標(biāo)象限（原先放置平臺(tái)的象限）所花的時(shí)間和進(jìn)入該象限的次數(shù)，以此作為空間記憶的檢測(cè)指標(biāo)。
2.2 文獻(xiàn)
Partial loss of psychiatric risk gene Mir137 in mice causes repetitive behavior and impairs sociability and learning via increased Pde10a.
2.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備
Morris水迷宮、VisuTrack V2.0軟件、攝像系統(tǒng)等。
2.4 實(shí)驗(yàn)方法
2.4.1 常用實(shí)驗(yàn)分組方法
1、已知品系的記憶缺陷轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型
(1)對(duì)照組：按照實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求選定（分類一：工具鼠的空載鼠，如Cre、Cas9、FLP鼠等；分類二：同籠陰性鼠、轉(zhuǎn)基因品系背景鼠等）
(2)轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M：不作任何處理的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
(3)轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)組：對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行額外處理，如給藥，注射病毒等
2、定向基因編輯待驗(yàn)證的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
(1)對(duì)照組：按照實(shí)際實(shí)驗(yàn)需求選定。（分類一：工具鼠的空載鼠，如Cre、Cas9、FLP鼠等；分類二：同籠陰性鼠、轉(zhuǎn)基因品系背景鼠等）
(2)轉(zhuǎn)基因組：不作任何處理的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物
3、驗(yàn)證藥物造模效果-學(xué)習(xí)記憶變強(qiáng)/變?nèi)?/strong>
(1)對(duì)照組：不作任何處理的動(dòng)物
(2)實(shí)驗(yàn)組：使用造模藥物使動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力變化的動(dòng)物
4、驗(yàn)證受試藥物對(duì)造模藥物的恢復(fù)效果
(1)對(duì)照組：不作任何處理的動(dòng)物
(2)藥物造模組：使用造模藥物使動(dòng)物出現(xiàn)記憶力問(wèn)題的動(dòng)物
(3)實(shí)驗(yàn)組：對(duì)藥物造模組動(dòng)物使用受試藥物恢復(fù)的動(dòng)物
*所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)流程，在實(shí)驗(yàn)開始就應(yīng)對(duì)需要給藥的動(dòng)物進(jìn)行給藥
2.4.2 適應(yīng)階段
實(shí)驗(yàn)開始前3-7天（自己繁育小鼠 Handle 3天，外購(gòu)動(dòng)物 Handle 7天），每天抓取、輕撫動(dòng)物，讓其熟悉實(shí)驗(yàn)人員手，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不會(huì)處于應(yīng)激狀態(tài)。
2.4.3 學(xué)習(xí)階段
1、旗幟標(biāo)記學(xué)習(xí)(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)置
在迷宮臂交叉垂直的四個(gè)方向的水面上方分別放置一個(gè)顯眼（與水面，窗簾的顏色不同）的標(biāo)志物（如圓形，方形，五角星，三角形等）可以貼在桶臂上，也可以貼在簾子上（需避免簾子在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中晃動(dòng)），或者房間墻壁上（此時(shí)需要沒有簾子）
將水面按照標(biāo)記物的位置分為4個(gè)象限，并將平臺(tái)放置于一個(gè)象限的中心
將平臺(tái)置于水下1-2厘米深（加入染料后，根據(jù)動(dòng)物游泳過(guò)程中水面波動(dòng)后，水平臺(tái)不會(huì)露出水面即可）。不宜太深，平臺(tái)過(guò)深會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物到達(dá)平臺(tái)后仍然繼續(xù)游走
在平臺(tái)上放置一個(gè)高于水面的標(biāo)記物，使動(dòng)物可以通過(guò)標(biāo)記物確認(rèn)平臺(tái)位置
(2)時(shí)間
根據(jù)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶水平，可設(shè)置0-6天的學(xué)習(xí)時(shí)間
(3)方法
將動(dòng)物分別從不同象限放入水中，讓動(dòng)物自由活動(dòng)尋找平臺(tái)。
動(dòng)物找到平臺(tái)：記錄時(shí)間，讓動(dòng)物在平臺(tái)停留30s，觀察周圍環(huán)境
動(dòng)物未找到平臺(tái)：動(dòng)物自由活動(dòng)1-2min（實(shí)驗(yàn)中保持一致，推薦1min）后， 將動(dòng)物引導(dǎo)至平臺(tái)所在處，并停留30s，讓動(dòng)物觀察周圍環(huán)境
每只動(dòng)物每天分別隨機(jī)從4個(gè)象限各進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)需要間隔至少2-3min（推薦2min），讓動(dòng)物補(bǔ)充體力。（方法一：兩只動(dòng)物同時(shí)開展實(shí)驗(yàn)，交替進(jìn)行學(xué)習(xí)，即動(dòng)物A進(jìn)行Trial1，接下來(lái)動(dòng)物B進(jìn)行Trial1，動(dòng)物A進(jìn)行Trial2依次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。方法二：?jiǎn)沃粍?dòng)物進(jìn)行4個(gè)Trial實(shí)驗(yàn)后，再開展另外一只動(dòng)物訓(xùn)練實(shí)驗(yàn)。）
(4)記錄數(shù)據(jù)
第一次到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期），總活動(dòng)軌跡、距離。
總活動(dòng)軌跡用于判斷動(dòng)物是否有不利于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的行為習(xí)慣（如繞圈，跳躍等），必要時(shí)以此剔除動(dòng)物
總活動(dòng)距離僅做動(dòng)物活躍程度參考，受潛伏期以及動(dòng)物活躍程度影響
潛伏期越短說(shuō)明動(dòng)物已經(jīng)學(xué)會(huì)找到平臺(tái)這一行為，學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)
2、平臺(tái)學(xué)習(xí)
(1)實(shí)驗(yàn)設(shè)置：取下平臺(tái)上高于水面的標(biāo)記物，其余保持不變
(2)時(shí)間：根據(jù)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶水平，可設(shè)置4-7天的學(xué)習(xí)時(shí)間
(3)方法：
將動(dòng)物分別從不同象限放入水中，讓動(dòng)物自由活動(dòng)尋找平臺(tái)。
動(dòng)物找到平臺(tái)：記錄時(shí)間，讓動(dòng)物在平臺(tái)停留30s，觀察周圍環(huán)境
動(dòng)物未找到平臺(tái)：動(dòng)物自由活動(dòng)1-2min（實(shí)驗(yàn)中保持一致，推薦1min）后， 將動(dòng)物引導(dǎo)至平臺(tái)所在處，并停留30s，讓動(dòng)物觀察周圍環(huán)境
每只動(dòng)物每天分別隨機(jī)從4個(gè)象限各進(jìn)行一次實(shí)驗(yàn)，兩次實(shí)驗(yàn)需要間隔至少2-3min（推薦2min），讓動(dòng)物補(bǔ)充體力
(4)記錄數(shù)據(jù)：第一次到達(dá)平臺(tái)的時(shí)間（潛伏期），總活動(dòng)軌跡、距離
總活動(dòng)軌跡用于判斷動(dòng)物是否有不良行為習(xí)慣（如繞圈，跳躍等），必要時(shí)以此剔除動(dòng)物
總活動(dòng)距離僅做動(dòng)物活躍程度參考，受潛伏期以及動(dòng)物活躍程度影響
潛伏期越短說(shuō)明動(dòng)物已經(jīng)學(xué)會(huì)找到平臺(tái)這一行為，學(xué)習(xí)能力越強(qiáng)
2.4.4 測(cè)試階段
1、實(shí)驗(yàn)設(shè)置
去除水中的平臺(tái)，其余保持不變
2、時(shí)間
平臺(tái)學(xué)習(xí)結(jié)束后一天
3、方法
將動(dòng)物在指定位置放入水迷宮中，讓動(dòng)物在水中自由活動(dòng)1-2min（推薦1min，與學(xué)習(xí)階段測(cè)試時(shí)間相同）
4、記錄數(shù)據(jù)
主要包括：平臺(tái)區(qū)域經(jīng)過(guò)次數(shù)、平臺(tái)區(qū)域停留時(shí)間、總活動(dòng)軌跡與距離、不同象限活動(dòng)時(shí)間、距離。
(1)經(jīng)過(guò)平臺(tái)區(qū)域次數(shù)為主要指標(biāo)，經(jīng)過(guò)次數(shù)越多，說(shuō)明動(dòng)物記憶越好
(2)平臺(tái)區(qū)域停留時(shí)間作為經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)的參考，部分動(dòng)物可能會(huì)在平臺(tái)區(qū)域停留，導(dǎo)致經(jīng)過(guò)平臺(tái)區(qū)域次數(shù)較少
(3)總活動(dòng)軌跡可以作為實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行展示
(4)當(dāng)經(jīng)過(guò)平臺(tái)次數(shù)，停留時(shí)間無(wú)顯著差異時(shí)，考慮分析平臺(tái)所在象限的活動(dòng)時(shí)間及距離是否有差異，部分動(dòng)物可能對(duì)平臺(tái)具體位置記憶不是特別清楚，但是會(huì)在平臺(tái)附近區(qū)域反復(fù)移動(dòng)
2.4.5 數(shù)據(jù)分析
1、不同時(shí)期分析的數(shù)據(jù)類型不同
2、采用單因素方差分析（one way-ANOVA），當(dāng)多組間有差異時(shí)，兩兩比較采用Fisher's LSD post hoc多重比較方法
3、P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異
1、實(shí)驗(yàn)時(shí)，建議將水溫維持在21℃-23℃范圍內(nèi)。水溫過(guò)低或過(guò)高均容易導(dǎo)致動(dòng)物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。
2、實(shí)驗(yàn)時(shí)間周期設(shè)置應(yīng)保證對(duì)照組對(duì)照組的動(dòng)物學(xué)會(huì)的最短時(shí)間為標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)會(huì)讓學(xué)會(huì)尋找平臺(tái)的動(dòng)物產(chǎn)生厭倦感，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
3、每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需要將動(dòng)物毛發(fā)擦干，避免動(dòng)物受涼死亡。
4、實(shí)驗(yàn)中需要在水中加入不易變質(zhì)的染料，不僅可以增加水面與動(dòng)物顏色的對(duì)比度，也可以防止動(dòng)物透過(guò)透明的水看到平臺(tái)。黑鼠棕鼠推薦使用鈦白粉做為染料；白鼠推薦使用食用黑色素作為染料。染料購(gòu)買可以咨詢上海欣軟工作人員。
另外還可選擇使用透明浮珠，其有反射少、蒸發(fā)少等特點(diǎn)，但是阻力大，會(huì)導(dǎo)致小鼠游泳非常累，因此不推薦。
5、實(shí)驗(yàn)進(jìn)行過(guò)程中不要進(jìn)行換水。雖然水池中會(huì)存在很多動(dòng)物排泄物導(dǎo)致異味產(chǎn)生，但換水操作可能會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物認(rèn)為進(jìn)入了一個(gè)新的環(huán)境而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
6、加入的染料易在水中沉降，每半天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前應(yīng)對(duì)水進(jìn)行攪拌，使染料重新分布均勻。
7、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每天都會(huì)有水的損耗，導(dǎo)致平臺(tái)深度越來(lái)越淺。建議實(shí)驗(yàn)開始前確定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)水位，后續(xù)每天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前，對(duì)迷宮進(jìn)行補(bǔ)水。
8、實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)盡可能保持安靜，避免聲音影響動(dòng)物對(duì)方向的判斷。
9、實(shí)驗(yàn)人員將鼠放入水迷宮后，應(yīng)盡快離開動(dòng)物視線區(qū)域以及視頻記錄區(qū)域，避免被動(dòng)物當(dāng)做標(biāo)記物，或被視頻記錄識(shí)別為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。
10、固定時(shí)間點(diǎn)開展實(shí)驗(yàn)。由于動(dòng)物節(jié)律問(wèn)題，在一天不同的時(shí)間段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不同。建議實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，不同實(shí)驗(yàn)組的動(dòng)物逐只或逐2只進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，可以獲得更為準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
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