研究背景

喉鱗狀細(xì)胞癌(Laryngealsquamouscellcarcinoma,LSCC)是頭頸部最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，并且一半以上的LSCC患者在確診時(shí)表現(xiàn)為晚期臨床階段。在過(guò)去四十年LSCC的五年存活率明顯下降，因此迫切需要發(fā)掘可靠的LSCC早期診斷靶點(diǎn)和評(píng)估預(yù)后的治療性生物標(biāo)志物，深入探索LSCC的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制。

環(huán)狀RNA是一種由信使RNA前體(pre-mRNA)經(jīng)3’-5’端反向剪接形成的單鏈閉環(huán)的非編碼RNA，大量、穩(wěn)定存在于細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞外，賦予環(huán)狀RNA高度保守、表達(dá)豐度高以及組織特異性的特點(diǎn)。近年研究報(bào)道中，環(huán)狀circRNA在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后表觀遺傳水平上參與了人類神經(jīng)精神疾病、心血管疾病等疾病特別是腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

C1QBP是一種普遍存在的多功能RNA結(jié)合蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，C1QBP參與黑色素瘤、宮頸鱗狀細(xì)胞癌和胰腺癌等，在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞遷移和腫瘤生長(zhǎng)的作用。然而，在機(jī)制中環(huán)狀RNA對(duì)泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的C1QBP降解調(diào)控模式尚未有報(bào)道過(guò)。

文獻(xiàn)來(lái)源

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院李凱課題組等人在Molecular Cancer雜志上發(fā)表論文“Circular RNA MTCL1 promotes advanced laryngeal squamous cell carcinoma progression by inhibiting C1QBP ubiquitin degradation and mediating beta-catenin activation”，揭示了circ-MTCL1 在轉(zhuǎn)錄后表觀遺傳水平調(diào)控 C1QBP 蛋白的泛素化降解，介導(dǎo) wnt/β-catenin 信號(hào)通路激活，促進(jìn)了LSCC腫瘤的發(fā)展。該研究為理解circRNA和相應(yīng)的RNA結(jié)合蛋白如何調(diào)控靶點(diǎn)提供了新的途徑，同時(shí)為L(zhǎng)SCC的防治提供了新的靶點(diǎn)和方向。

項(xiàng)目研究

基于RNA測(cè)序，作者針對(duì)LSCC患者樣本及其匹配的ANM組織進(jìn)行了差異表達(dá)譜分析，篩選得到circMTCL1分子作為后續(xù)研究對(duì)象。結(jié)合臨床樣本數(shù)據(jù)和生信分析顯示，circMTCL1在LSCC細(xì)胞和患者中上調(diào)，circMTCL1的高表達(dá)與腫瘤分化(P= 0.003)、T分期(P=0.001)、淋巴轉(zhuǎn)移(P=0.001)和臨床分期(P=0.001)顯著相關(guān)，且circMTCL1的高表達(dá)可以作為預(yù)測(cè)LSCC患者臨床結(jié)局的獨(dú)立預(yù)后因素。

FISH和qPCR的定位分析顯示circMTCL1主要分布于胞質(zhì)中。為了研究circMTCL1在LSCC中的調(diào)控模式，作者借助RNA pull-down和質(zhì)譜技術(shù)，找了與circMTCL1互作的RNA結(jié)合蛋白C1QBP。WB和RT檢測(cè)circMTCL1可以在轉(zhuǎn)錄后水平正調(diào)控C1QBP的表達(dá)。隨后用CHX和蛋白酶體抑制劑MG132處理檢測(cè)了C1QBP的半衰期，免疫共沉淀結(jié)果顯示circMTCL1通過(guò)抑制泛素-蛋白酶體途徑抑制C1QBP的降解，從而提高了C1QBP的蛋白表達(dá)水平。

為了確定circMTCL1在LSCC中的功能作用，作者對(duì)circMTCL1進(jìn)行過(guò)表達(dá)和干擾，基于之前的KEGG分析，C1QBP可以富集在典型的Wnt信號(hào)通路中，WB檢測(cè)circMTCL1的表達(dá)與β-catenin磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)。隨后通過(guò)EDU、Transwell、傷口愈合試驗(yàn)結(jié)果表明circMTCL1增強(qiáng)了TU212和LCC細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力；在si-C1QBP挽救實(shí)驗(yàn)中顯示circMTCL1可能以C1QBP依賴的方式靶向Wnt/β-catenin通路，促進(jìn)LSCC的生物學(xué)功能。

為了進(jìn)一步闡明在LSCC細(xì)胞中circMTCL1與C1QBP相互作用的分子機(jī)制，作者設(shè)計(jì)了針對(duì)C1QBP蛋白關(guān)鍵結(jié)合位點(diǎn)的circMTCL1野生型和突變型探針，RNA下拉分析到僅野生型circMTCL1(+ 159?+ 210)探針可以富集到內(nèi)源性C1QBP蛋白。RIP試驗(yàn)反向證實(shí)了這一點(diǎn)。

接下來(lái)，作者又針對(duì)C1QBP-β-catenin下游調(diào)控模式進(jìn)一步驗(yàn)證，過(guò)表達(dá)C1QBP抑制β-catenin磷酸化水平，顯著增加其蛋白表達(dá)，敲低則反之。Transwell和克隆形成試驗(yàn)表明C1QBP同樣可以TU212和LCC細(xì)胞增殖，遷移和侵襲能力，然后COIP正反驗(yàn)證C1QBP和β-catenin之間存在直接相互作用。綜上所述，C1QBP在LSCC組織中與致癌蛋白β-catenin相互作用，激活了由circMTCL1介導(dǎo)的Wnt/β-catenin通路。

在circMTCL1體內(nèi)的功能作用驗(yàn)證中，作者通過(guò)背部皮下注射穩(wěn)定轉(zhuǎn)染circMTCL1 shRNA或?qū)φ章《镜腡U212細(xì)胞進(jìn)行異種移植試驗(yàn)，結(jié)果顯示降低circMTCL1的表達(dá)能顯著降低TU212細(xì)胞的致瘤性，并且顯著減小了腫瘤體積和腫瘤重量。將sh-circMTCL1 TU212細(xì)胞注入尾靜脈構(gòu)建LSCC轉(zhuǎn)移小鼠模型，circMTCL1敲低可降低肺轉(zhuǎn)移，這與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相一致。

綜上所述，circMTCL1通過(guò)特定的結(jié)合序列與C1QBP相互作用，通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑抑制其降解，提高C1QBP的表達(dá)，增強(qiáng)了C1QBP與β-catenin的相互作用，阻止β-catenin的磷酸化，使β-catenin在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中積累，從而促進(jìn)細(xì)胞在體內(nèi)和體外的增殖、侵襲和遷移。

文獻(xiàn)來(lái)源：www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8976408/

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