基因克隆是分子生物學(xué)中的一種基本的操作方法。通過(guò)雙酶切來(lái)構(gòu)建載體是其中常用的一種方法，這種方法利用限制性內(nèi)切酶可以識(shí)別并切割特定的核苷酸的原理，用兩種不同的限制性內(nèi)切酶切割靶基因得到前后都帶有粘性末端的靶基因片段，與同樣經(jīng)兩種限制性內(nèi)切酶切割得到的帶有相同粘性末端的線性載體在T4 DNA連接酶作用下進(jìn)行連接，從而實(shí)現(xiàn)基因克隆。但是在實(shí)際操作中經(jīng)常會(huì)遇到酶切效率及連接效率不高等問(wèn)題，致使靶基因片段插入載體相當(dāng)困難，為此人們采取了多種策略進(jìn)行克隆。最近開(kāi)發(fā)了一種叫做同源重組的基因克隆方法， 相比雙酶切載體構(gòu)建方法，該方法的構(gòu)建過(guò)程有些不同。首先，靶基因片段擴(kuò)增引物有別于常規(guī)引物設(shè)計(jì)；其次，載體切割過(guò)程中只需要進(jìn)行單酶切；第三，載體和目的基因片段的連接是基于同源重組而不是粘性末端互補(bǔ)。

?

載體構(gòu)建是分子生物研究常用的手段之一，整個(gè)過(guò)程包括目的基因擴(kuò)增，載體和目的基因酶切，末端間連接，感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和陽(yáng)性克隆的篩選，每一個(gè)步驟都必須嚴(yán)格控制其反應(yīng)條件。

?

雙酶切構(gòu)建載體方法比較繁瑣。

首先，對(duì)引物的設(shè)計(jì)有著嚴(yán)格的要求，引物的長(zhǎng)度一般為18-25bp，GC含量控制在40%-60%，上、下游引物之間GC含量不能相差太大，引物中需要加入酶切位點(diǎn)及保護(hù)性堿基。引物設(shè)計(jì)不當(dāng)可能在擴(kuò)增時(shí)生成引物二聚體，給實(shí)驗(yàn)帶來(lái)不便。

其次，目的基因有必要進(jìn)行TA克隆。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)操作中，可能會(huì)由于酶切效率和連接效率低等原因使得載體構(gòu)建相當(dāng)困難，目的基因擴(kuò)增在這些步驟之前，由于PCR擴(kuò)增是體外擴(kuò)增，很容易發(fā)生突變，TA克隆有著成功率高的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)TA克隆將目的基因構(gòu)建進(jìn)pMD 19T進(jìn)而轉(zhuǎn)化入大腸桿菌中，單克隆菌體自身的修復(fù)機(jī)制可保證單一的克隆，利于篩選需要的序列，通過(guò)后續(xù)測(cè)序鑒定可以得到大量正確的目的基因片段，而且直接將PCR產(chǎn)物切下來(lái)不易產(chǎn)生粘性末端，連接入表達(dá)載體比較困難，通過(guò)TA克隆酶切的目的片段產(chǎn)生粘性末端的概率很高。

第三，雙酶切效率不高。由于不同的酶所對(duì)應(yīng)的緩沖液不同，內(nèi)切酶只有在最適的緩沖液環(huán)境下效率才能得到最優(yōu)化，但是雙酶切體系勢(shì)必使其中一個(gè)酶的活性有所損失。這樣必定會(huì)使酶切產(chǎn)物不純。酶切產(chǎn)物中既有單酶切線性載體，也有雙酶切線性載體，使得連接時(shí)所需要的雙酶切線性載體的量失準(zhǔn)，影響連接效率。因此可以先用一個(gè)限制性內(nèi)切酶切割純化回收，但工作量較大，回收率低。

第四，連接效率低。pMIR reporter與目的片段的摩爾比很重要，一般在3:1-10:1間浮動(dòng)，而且連接效率和連接反應(yīng)體積也有關(guān)系。

二、同源重組法構(gòu)建載體??????????

采用同源重組法構(gòu)建載體與常規(guī)雙酶切構(gòu)建載體方法不同。

首先，設(shè)計(jì)引物時(shí)上游引物5’端前面加的是酶切位點(diǎn)（如Hind III）及該酶切位點(diǎn)在pMIR reporter載體中對(duì)應(yīng)前面的15個(gè)堿基載體片段，下游引物5’端前面加的是Hind III酶切位點(diǎn)及該酶切位點(diǎn)在pMIR reporter載體中對(duì)應(yīng)后面的15個(gè)堿基載體片段，如此設(shè)計(jì)引物是為了保證目的片段插入載體時(shí)方向正確。

其次，載體只需要單酶切，用Hind III酶切pMIR reporter，使得pMIR reporter成為兩端都帶著Hind III位點(diǎn)的線性載體。相比雙酶切切割載體，單酶切可以保證酶切后的載體都是單一的線性片段，使得后續(xù)的重組連接更準(zhǔn)確。

第三，省去了TA克隆環(huán)節(jié)。因?yàn)镻CR產(chǎn)物可以直接用于重組連接，不需要酶切產(chǎn)生粘性末端，而且重組酶的重組能力強(qiáng)于T4 DNA連接酶的連接能力，一般只需要一步即可重組連接成功，因此可以在重組反應(yīng)之后進(jìn)行測(cè)序鑒定。

?

總之，兩種方法各有利弊，雙酶切構(gòu)建過(guò)程比較繁瑣，同源重組構(gòu)建過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單，可以省去很多的時(shí)間和精力，但假陽(yáng)性率略高。