2022年1月，歐易/鹿明生物合作客戶浙江大學(xué)夏宜平教授課題組在Hortic Res.期刊發(fā)表的題為“Photoprotection contributes to freezing tolerance as revealed by RNA-seq profiling of Rhododendron leaves during cold acclimation and deacclimation over time”的研究成果，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)、靶向代謝組學(xué)技術(shù)研究方法，發(fā)現(xiàn)了杜鵑葉片通過(guò)光合作用和積累碳水化合物以及降低ABA、JA和木質(zhì)素含量來(lái)獲得抗凍性。

中文標(biāo)題：通過(guò)對(duì)杜鵑葉片的RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)：在低溫馴化和去低溫馴化過(guò)程中光保護(hù)有助于提高杜鵑葉片的抗凍性

研究對(duì)象：植物葉片

發(fā)表期刊：Hortic Res.

影響因子：6.793

發(fā)表時(shí)間：2022年1月

發(fā)表單位：浙江大學(xué)

運(yùn)用生物技術(shù)：轉(zhuǎn)錄組學(xué)、靶向代謝組學(xué)(由鹿明生物提供技術(shù)支持)?

研究背景

冷凍耐受（FT）是北溫帶植物的一項(xiàng)獲得性能力。多年生的木本植物在秋冬兩季較短的光周期和較低的溫度下逐漸獲得FT的過(guò)程稱為“低溫馴化”(CA)，而植物在高溫下逐漸失去獲得的FT的過(guò)程稱為“去低溫馴化”(DA)。近年來(lái)，由于暖冬和非季節(jié)性氣溫變暖導(dǎo)致一些植物不完全的CA和未成熟的DA，而這種對(duì)寒冷的反應(yīng)會(huì)給這些植物帶來(lái)一系列的威脅。

早期研究?jī)H僅關(guān)注CA的低溫研究，然而溫度的季節(jié)性變化常常伴隨著光照的變化，單單研究溫度變化限制了對(duì)CA過(guò)程的深入了解；研究者認(rèn)識(shí)到這一點(diǎn)之后，開(kāi)始關(guān)注光照對(duì)CA過(guò)程的影響。然而，DA作為一個(gè)很重要的過(guò)程，其研究卻常常被忽略。

研究思路

研究結(jié)果

植物生長(zhǎng)與葉片抗凍性(LFT)

圖1中的a和b圖展示了研究期間氣溫和光照變化。莖在11月初逐漸停止生長(zhǎng)，直到3月才恢復(fù)生長(zhǎng)（圖1c）；花蕾在12月逐漸停止生長(zhǎng)，次年2月恢復(fù)生長(zhǎng)。結(jié)果表明，葉片出芽的時(shí)間與花芽恢復(fù)生長(zhǎng)的時(shí)間基本一致，比莖恢復(fù)生長(zhǎng)的時(shí)間提前約1個(gè)月。葉片耐受以LT（引起50%葉片損傷的溫度）表示，LT從09月27日至10月24日變化不大，但光周期縮短了0.8h；從10月24日至1月19日，隨著溫度和光周期的降低，葉片的抗凍性(LFT)開(kāi)始增加，1到4月隨著溫度和光周期的增加，LFT逐漸降低。這些數(shù)據(jù)表明，在CA期間，隨著莖的停止生長(zhǎng)，LFT增加；而在DA期間，隨著葉芽的出現(xiàn)以及花芽和莖的再生，LFT減少；開(kāi)花后，葉片完全失去獲得的LFT。

圖1 | 環(huán)境對(duì)植物生長(zhǎng)的影響

植物的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

為了研究CA和DA整個(gè)過(guò)程，作者對(duì)所有的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行了PCA分析。通過(guò)時(shí)序比較，總計(jì)有25148個(gè)基因在至少其中一組中差異表達(dá)，其中有10435，8404，5201，6012和12386個(gè)差異基因分別屬于1到5時(shí)期。對(duì)這5個(gè)時(shí)期做KEGG分析，發(fā)現(xiàn)在每一個(gè)時(shí)期都富集到“苯丙素的生物合成”，“MAPK信號(hào)通路-植物”，“晝夜節(jié)律-植物”等6條通路，表明這些過(guò)程在CA和DA都處于活躍階段。

為了確定轉(zhuǎn)錄組學(xué)的時(shí)間特征，使用Mfuzz對(duì)18個(gè)樣本的25148個(gè)差異轉(zhuǎn)錄基因（DET）進(jìn)行聚類分析，將所有差異轉(zhuǎn)錄基因劃分為10個(gè)聚類。選取每個(gè)聚類的顯著富集的通路，并繪制熱圖。

聚類10中的DETs可能在冬季提供最強(qiáng)的LFT，因?yàn)槠渥罡弑磉_(dá)出現(xiàn)在LFT最強(qiáng)時(shí)?！吧砉?jié)律”也富集在聚類10，同時(shí)也富集于聚類2、5、9。因此，“晝夜節(jié)律”通路可能代表時(shí)期2、3、5的不同變化，這三者對(duì)于CA或早期DA反應(yīng)中獲得LFT的過(guò)程都具有重要作用。

作者分析了每個(gè)聚類中與“晝夜節(jié)律”相關(guān)的DETs，發(fā)現(xiàn)標(biāo)注為“cryptochrome1(CRY1)”和“bHLH/PIF3”的DETs僅在聚類10中富集。因此，CRY1s和PIF3s的上調(diào)可能在葉片獲得最強(qiáng)LFT中起重要作用。

圖2 | 杜鵑葉片的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析

基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（WGCNA）及生理參數(shù)與DETs的關(guān)系

通過(guò)WGCNA分析探究DETs和生理參數(shù)，將DETs分為20個(gè)模塊。三個(gè)模塊（紅色、藍(lán)色、藍(lán)綠色）的p值均小于0.01，接下來(lái)對(duì)他們做進(jìn)一步分析。紅色模塊中，DETs從9月27日到1月19日分別上調(diào)和下調(diào)，而從1月19日到4月18日又分別下調(diào)和上調(diào)，這一模塊的基因富集于“生理節(jié)律”，“ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體”和“植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)”；藍(lán)色模塊的基因從9月27日到11月28日分別上調(diào)和下調(diào)，并到1月19一直保持上升，再分別下調(diào)和上調(diào)，這些基因富集于“生理節(jié)律”等8個(gè)信號(hào)通路；在藍(lán)綠色模塊中，DETs從9月27日到11月9日分別快速下降和上升，并持續(xù)下降和上升到11月28日，而從3月20日到4月18日分別上升和下降，這些基因富集于“植物病原菌互作”等通路?；谶@些分析表明“生理節(jié)律”是最顯著富集的通路。

圖3 | 基因共表達(dá)及與生理參數(shù)的關(guān)系分析

通過(guò)靶向代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在藍(lán)綠色模塊中，“淀粉和蔗糖代謝”與碳水化合物代謝有關(guān)，“α-亞麻酸代謝”和“亞油酸代謝”是JA生物合成的上游，“類胡蘿卜素生物合成”是脫落酸（ABA）生物合成的上游，“苯丙素生物合成”是木質(zhì)素生物合成的上游。因此，對(duì)6個(gè)時(shí)間點(diǎn)的碳水化合物(葡萄糖、果糖和蔗糖)、ABA、JA和木質(zhì)素含量進(jìn)行檢測(cè)。果糖和葡萄糖與紅色模塊高度相關(guān)，蔗糖與藍(lán)色模塊高度相關(guān)，ABA、JA、肉桂酸、阿魏酸和芥子酸的含量與藍(lán)綠色模塊高度相關(guān)，無(wú)模塊與對(duì)香豆酸相關(guān)。由于紅色、藍(lán)色和藍(lán)綠色模塊與LT高度相關(guān)，那么葡萄糖、果糖、蔗糖、ABA、JA和木質(zhì)素含量也與LT值相關(guān)。同時(shí)，“生理節(jié)律”在紅色和藍(lán)色模塊都最顯著富集，顯示了其與糖的相關(guān)性。而ABA、JA和木質(zhì)素含量和藍(lán)綠色模塊顯示了最強(qiáng)的相關(guān)性。以上結(jié)果說(shuō)明了糖與“生理節(jié)律”，ABA，JA與木質(zhì)素之間在CA和DA時(shí)期的相互作用。

圖4 | 糖(a)、脫落酸(b)、茉莉酸(c)、肉桂酸(d)、對(duì)香豆酸(e)、阿魏酸(f)和芥子酸(g)在CA和DA期間的含量變化

探究光保護(hù)與晝夜節(jié)律的關(guān)系

作者運(yùn)用超微結(jié)構(gòu)透射電子顯微鏡探究光保護(hù)相關(guān)的DETs與晝夜節(jié)律相關(guān)的基因共表達(dá)，提示CA和DA期間可能存在光保護(hù)與晝夜節(jié)律的關(guān)系。此外,葉綠體超微結(jié)構(gòu)顯示：作者發(fā)現(xiàn)了顆粒堆積的大量損失和類囊體的脫落，同時(shí)發(fā)現(xiàn)葉綠體在光照強(qiáng)度為80μmol m s、每天14h、22℃下，6天恢復(fù)。

圖5 | 通過(guò)葉綠素?zé)晒?a，b，c，d)和葉綠素超微結(jié)構(gòu)透射電子顯微照片(e，f)研究了“miyono-sakae”杜鵑越冬葉片PSII光化學(xué)性能的季節(jié)動(dòng)態(tài)

CA和DA過(guò)程中ABA、JA和木質(zhì)素相關(guān)基因的變化

從香葉酰二磷酸到紫黃質(zhì)，大多數(shù)DETs在高表達(dá)，兩種分解ABA的酶——UDP葡萄糖轉(zhuǎn)移酶和ABA8'-羥化酶低表達(dá)。ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，PYLs多在高表達(dá)，PP2Cs和SnRK2s多高表達(dá)。大部分PP2Cs和SnRK2s的變化趨勢(shì)與ABA含量的變化趨勢(shì)一致。與JA生物合成相關(guān)的DETs變化與JA含量變化基本一致；與JA分解代謝相關(guān)的DETs的表達(dá)量與JA含量相反。

此外，“葉綠體包膜醌氧化還原酶(QORH)”和“PsbP”的DETs在JA生物合成途徑“α-亞麻酸代謝”中富集，并呈現(xiàn)高表達(dá)。QORH位于葉綠體包膜的內(nèi)膜，可以使多不飽和脂肪酸過(guò)氧化物的產(chǎn)物解毒。PsbP是PSII的一個(gè)外源性亞基，參與光合作用水氧化的正常功能。在JA信號(hào)中，除COIs高表達(dá)外，大部分JAZs和MYC2s的DETs的變化趨勢(shì)與JA內(nèi)容相似，CA過(guò)程中ABA和JA含量的季節(jié)變化與之前對(duì)“Elsie Lee”杜鵑越冬葉的研究結(jié)果一致。

雖然“苯丙氨酸解氨酶(PAL)”和“肉桂酸4-單加氧酶(C4H)”的DETs高表達(dá)，肉桂酸和對(duì)香豆酸的含量有所下降。這表明，肉桂酸和對(duì)香豆酸在CA的轉(zhuǎn)錄水平上沒(méi)有受到調(diào)控。對(duì)香豆酸、阿佛酸和芥子酸是對(duì)香豆醇、針葉樹(shù)醇和芥子醇三種單木質(zhì)素的前體，阿魏酸和芥子酸含量大幅下降?！?-香豆酸-輔酶a連接酶(4CL)”、“肉桂酰輔酶a還原酶(CCR)”、“肉桂醇脫氫酶(CAD)”和“過(guò)氧化物酶(PRX)”參與木質(zhì)素的生物合成。

過(guò)氧化物酶催化是H-、G-或S-木質(zhì)素形成的最后一步，PRXs在CA和DA過(guò)程中沒(méi)有明顯的變化趨勢(shì)。此外，16個(gè)BGLUs中有10個(gè)在CA期間下調(diào)，在DA期間上調(diào)。BGLUs能水解針葉樹(shù)蛋白，釋放出針葉樹(shù)醇。針葉醇是針葉醇的4- o -葡萄糖苷，被認(rèn)為是單醇的一種運(yùn)輸或儲(chǔ)存形式。BGLU和PRX是木質(zhì)素生物合成的最后一個(gè)步驟，都發(fā)生在細(xì)胞壁中。

圖6 | 脫落酸(ABA)、茉莉酸(JA)和木質(zhì)素途徑

研究結(jié)論

結(jié)合前期成果，本研究發(fā)現(xiàn)晝夜節(jié)律可能在杜鵑花葉片冬季獲得LFT過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。WGCNA分析揭示某些晝夜節(jié)律相關(guān)基因在CA過(guò)程中上調(diào)，在DA過(guò)程中下調(diào)，可能分別與糖的積累和分解代謝有關(guān)。在CA期間，兩種杜鵑越冬葉片ABA和JA含量均有所下降，直到完全喪失LFT后才恢復(fù)。LFT與ABA或JA含量的負(fù)相性與其他組織(如芽和莖)或其他植物(如擬南芥和水稻)的負(fù)相性有很大的不同。其原因可能是在野外環(huán)境下，CA的誘導(dǎo)光保護(hù)作用。冬季ABA和JA生物合成的降低可能導(dǎo)致木質(zhì)素含量的降低。因此，作者提出，在野外條件CA的低溫和強(qiáng)光脅迫下，越冬葉片獲取LFT的機(jī)制是獨(dú)特的。這是通過(guò)光合作用和積累碳水化合物以及ABA、JA和木質(zhì)素含量的降低來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

小鹿推薦

在本研究中，研究者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)、靶向代謝組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了杜鵑越冬時(shí)，葉片獲取LFT的獨(dú)特機(jī)制。同時(shí)靶向代謝組學(xué)技術(shù)，已經(jīng)作為一種較為成熟的研究手段，可以對(duì)我們前期關(guān)注的代謝物進(jìn)行分析，作為非靶向代謝組學(xué)技術(shù)的一種補(bǔ)充和證明。提供多種代謝組學(xué)檢測(cè)服務(wù)，包括LC-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)、GC-MS非靶向代謝組學(xué)技術(shù)、脂質(zhì)組學(xué)技術(shù)和空間代謝組學(xué)。

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本文系鹿明生物原創(chuàng)