分子信標(biāo)探針的設(shè)計使寡核苷酸具有互補(bǔ)序列，從而形成莖環(huán)。 隨著淬滅劑和報告分子結(jié)合到寡核苷酸的每一端，以及引物環(huán)化，淬滅劑和報告分子處于近距離。

與水解探針一樣，分子信標(biāo)探針包含相同的元素。 它有一個寡核苷酸（寡核苷酸）、一個熒光報告基因和一個淬滅劑。

圖 1. 分子信標(biāo)探針由互補(bǔ)寡核苷酸、熒光報告基因和猝滅劑組成。 然而，結(jié)構(gòu)的不同之處在于寡核苷酸形成莖環(huán)，使報告基因和猝滅劑靠得更近。

分子信標(biāo)探針如何工作？

在 qPCR 中，引物的環(huán)部分與目標(biāo)序列的 15-30 個核苷酸部分雜交。

當(dāng)環(huán)與目標(biāo)序列結(jié)合時，它會導(dǎo)致莖變性。 莖變性后，報告基因和猝滅劑分離，游離熒光報告基因發(fā)出熒光。

與水解探針不同，熒光報告基因與猝滅劑分離，但不會被聚合酶去除。 因此，使用缺乏 5' 核酸外切酶活性的 DNA 聚合酶。

圖 2. 顯示分子信標(biāo)探針的工作原理。 一旦探針與互補(bǔ)序列結(jié)合，莖就會變性，導(dǎo)致報告基因和淬滅劑相距太遠(yuǎn)，淬滅劑無法發(fā)揮作用。 結(jié)果，報告基因發(fā)出熒光。

分子信標(biāo)探針的一些優(yōu)點是高特異性和多路復(fù)用能力（在同一次運行中識別多個目標(biāo)序列）。

一個顯著的缺點涉及設(shè)計探針的復(fù)雜性。 例如，寡核苷酸序列（形成莖）必須足夠強(qiáng)以避免報告基因和淬滅劑分離導(dǎo)致假熒光。