代謝組學(xué)是對(duì)生物體某一特定組分所包含的所有代謝物進(jìn)行定性及定量分析，并研究該代謝組在外界干預(yù)或疾病生理?xiàng)l件下動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的一門學(xué)科。代謝組學(xué)是一門交叉性極強(qiáng)的學(xué)科，我們經(jīng)常講，代謝組學(xué)是用物理學(xué)原理的設(shè)備，檢測(cè)化學(xué)原理的化合物，然后通過(guò)計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)，分析生物學(xué)機(jī)理，最終闡述醫(yī)學(xué)等各種現(xiàn)象，真的是相當(dāng)?shù)膹?fù)雜。

百趣代謝組學(xué)研究中心專家亮哥從事代謝組學(xué)檢測(cè)分析工作十幾年，從不懂到懂一點(diǎn)，也是有非常漫長(zhǎng)的過(guò)程。然而最近亮哥看一些文章，聽(tīng)一些報(bào)告，和客戶朋友聊一些天，發(fā)現(xiàn)大家對(duì)代謝組學(xué)研究依然有很多誤區(qū)。故而總結(jié)這十大誤區(qū)供大家討論及參考：

誤區(qū)九：代謝組學(xué)檢測(cè)中色譜圖中峰的高低代表物質(zhì)含量的高低？

很多客戶朋友做完項(xiàng)目以后經(jīng)常性提出的一個(gè)要求是希望我們把物質(zhì)標(biāo)注在色譜圖上（如下圖a, b標(biāo)注），這樣做合不合理呢？

圖1. GC-TOF-MS總離子流色譜圖

另外，還有個(gè)小故事：

一次，我們的結(jié)果顯示某個(gè)物質(zhì)（比如a）的峰面積遠(yuǎn)大于另外一個(gè)物質(zhì)（比如b），這跟客戶所知道的常識(shí)是相違背的，根據(jù)常識(shí)，該物種中a的含量是低于b的含量的，于是對(duì)我們的結(jié)果產(chǎn)生質(zhì)疑，本著顧客是上帝的原則，公司將項(xiàng)目款悉數(shù)退還。大概半年以后，客戶了解到這是質(zhì)譜檢測(cè)的一種正?，F(xiàn)象，直呼公司大氣，有大公司風(fēng)范，從此成為公司的鐵桿粉絲。

以上兩種情況，都是出于對(duì)色譜質(zhì)譜的譜峰理解有誤所致。

圖1我們展示的是GC-MS的總離子流色譜圖（Total Ion Chromatogram, TIC），TIC圖是將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜中所有離子的信號(hào)強(qiáng)度加和后連續(xù)描繪得到的譜圖，圖中橫坐標(biāo)是代謝物在色譜中的保留時(shí)間（RT），縱坐標(biāo)是離子強(qiáng)度；

但是，我們?nèi)庋劭吹降囊粋€(gè)譜峰就是一個(gè)代謝物嗎？

此時(shí)我們要引入一個(gè)提取離子流的概念。

提取離子流色譜圖（Extracted Ion Chromatogram, EIC）是指某個(gè)特定質(zhì)荷比的離子的色譜圖，EIC圖的峰面積才是用于代謝物定量分析的峰面積。

如下圖所示，一個(gè)TIC圖內(nèi)部可能包含多個(gè)EIC圖，這就是我們通常所說(shuō)的共流出的概念。

所以除非我們所檢測(cè)的樣品里面的物質(zhì)是簡(jiǎn)單的，沒(méi)有共流出的現(xiàn)象，否則我們?cè)赥IC圖上標(biāo)示物質(zhì)的做法是不可取的，針對(duì)生物樣品的復(fù)雜體系，大部分我們?nèi)庋鬯?jiàn)的TIC譜峰，都是包含多個(gè)特征離子的。

圖2. TIC圖下的EIC及特征離子的質(zhì)譜圖（A, B, C）

我們?cè)賮?lái)看看幾個(gè)LC-MS的TIC色譜峰圖：

圖3. 人血漿QC樣品正離子模式（POS）的TIC疊圖-18min

圖4. 人血漿QC樣品負(fù)離子模式（NEG）的TIC疊圖-18min

從圖形上可以看出，在同一個(gè)批次內(nèi)，峰圖具有非常好的重現(xiàn)性。這也是判斷一個(gè)實(shí)驗(yàn)做的好不好的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)之一。

那么我們換一個(gè)體系，采用12分鐘的方法來(lái)做呢？

圖5. 第一批人血漿樣品正離子模式（POS）的TIC圖-12min

圖6. 第一批人血漿樣品負(fù)離子模式（NEG）的TIC圖-12min

大家會(huì)發(fā)現(xiàn)，換體系以后，同樣都是人血漿樣品（不是同一個(gè)樣品），出來(lái)的譜峰差異很大。那是不是意味著代謝組學(xué)的檢測(cè)很不穩(wěn)定，批次效應(yīng)沒(méi)有辦法解決呢？

我們?cè)賮?lái)一批血漿，進(jìn)一步來(lái)看相同的儀器，相同的體系（SOP），在不同的時(shí)間，不同的人員檢測(cè)不同批次的人血漿（不是同一個(gè)樣品）重現(xiàn)性如何呢？

圖7. 第二批人血漿樣品正離子模式（POS）的TIC圖-12min

圖8. 第二批人血漿樣品負(fù)離子模式（NEG）的TIC圖-12min

為了方便對(duì)照，我們將圖形放在一起來(lái)看一下：

圖9. 前后兩批人血漿樣品正離子模式（POS）的TIC圖-12min

圖10. 前后兩批人血漿樣品負(fù)離子模式（NEG）的TIC圖-12min

由此至少可以看出，在相同的儀器及相同的體系（SOP）下，不同批次的人血漿樣品（不同的時(shí)間，不同的操作人員，不同的樣品）的出峰規(guī)律還是非常一致的。

盡管如此，我們也不能忽視批次效應(yīng)帶來(lái)的數(shù)據(jù)不穩(wěn)定。那如果我們要做一個(gè)超大型的隊(duì)列，比如1萬(wàn)例樣品的LC-MS非靶代謝組檢測(cè)，如何進(jìn)行大型隊(duì)列的設(shè)計(jì)，避免批次效應(yīng)帶來(lái)的影響呢？這個(gè)下次再講。

回到LC-MS的色譜峰上，還有一種常見(jiàn)的色譜峰圖叫基峰圖（Base Peak Chromatogram, BPC）,是將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜圖中最強(qiáng)的離子的強(qiáng)度連續(xù)描繪得到的圖譜。最強(qiáng)的總是最少的，這樣得到的峰圖峰的數(shù)量看起來(lái)就比較尖銳，比較多，這并不是做了什么方法學(xué)的優(yōu)化，實(shí)際上這只是色譜圖的一種呈現(xiàn)形式而已，往往發(fā)文章的時(shí)候有評(píng)審專家會(huì)認(rèn)為BPC圖不是樣品真實(shí)的反映，所以不接受BPC的投稿，只接受TIC，這個(gè)要特別注意。

圖11. 第二批人血漿樣品正離子模式（POS）的BPC圖-12min

圖12. 第二批人血漿樣品負(fù)離子模式（NEG）的BPC圖-12min

最后我們?cè)俜治鲆幌律衔闹心莻€(gè)小故事的情況。

為啥非靶標(biāo)代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中物質(zhì)的峰面積不能代表物質(zhì)的真實(shí)含量呢？

通過(guò)上面的對(duì)峰圖的理解，我們已經(jīng)知道，峰面積的半定量我們是依據(jù)提取離子流色譜圖的峰面積進(jìn)行的，由于每個(gè)化合物在質(zhì)譜中的離子化效率以及質(zhì)譜檢測(cè)器的高能打拿極對(duì)于不同離子的電子置換效率不同等因素，使得儀器檢測(cè)到的峰強(qiáng)度并不能反映化合物的真實(shí)含量，不過(guò)，對(duì)于不同的樣品，同一個(gè)物質(zhì)峰是在相同的情況下采集的，可以做比較，故而非靶代謝組學(xué)只能用來(lái)尋找樣品間或組間的差異，而不能對(duì)同一個(gè)樣品內(nèi)的不同物質(zhì)進(jìn)行濃度含量的比較。

總結(jié)一下亮哥這次分享的經(jīng)驗(yàn)要點(diǎn)：

1. 針對(duì)復(fù)雜的生物樣品，不可以在TIC圖上標(biāo)示物質(zhì)。

2. 質(zhì)譜對(duì)于不同的物質(zhì)，響應(yīng)不一樣，故在非靶代謝組學(xué)中，同一個(gè)樣品內(nèi)的不同物質(zhì)不可以進(jìn)行物質(zhì)含量的比較。

文/亮哥聊代謝組學(xué)