以Chi-miR-204-3p為例

Mature sequence : GCUGGGAAGGCAAAGGGAC

換U為T(mén)，便于后續(xù)使用 : GCTGGGAAGGCAAAGGGAC

chi-miR-204-3p的后8位：AAAGGGAC

chi-miR-204-3p的后8位的反向互補(bǔ)序列 : GTCCCTTT

莖環(huán)引物序列： RT stem-loop primer 反轉(zhuǎn)錄用這個(gè)引物和U6下游引物

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacGTCCCTTT

反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA鏈序列：

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacGTCCCTTTGTCCCTTTGCCTTCCCAGC

通過(guò)Primer5設(shè)計(jì)的引物：定量使用這對(duì)引物

q-chi-miR-204-3p-F: GCCCGGCTGGGAAGGCAAA

GCCCG（保護(hù)堿基）GCTGGGAA（結(jié)合位點(diǎn)）GGCAAA（位點(diǎn)后序列,挑選AT）

q-miRNA-unibersal-R2:CGCAGGGTCCGAGGTATTC?? 下游為通用引物 不必調(diào)換

?

RT-PCR：

下以PrimeScript?? RT? reagent? Kit (TaKaRa RR037A)為例：

取200ul 的 PCR 管，根據(jù)所得每組RNA 的濃度，每孔加入800ng 總RNA，計(jì)算出所需RNA 的體積。然后按TaKaRa 公司PrimeSriptTM RT Reagent Kit 建議的20μL 反應(yīng)體系說(shuō)明.

?

如果需要檢測(cè)多個(gè)miRNA，則將miRNA和U6各自分開(kāi)逆轉(zhuǎn)錄。

如果只檢測(cè)單個(gè)miRNA，可在同一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄體系中同時(shí)添加U6逆轉(zhuǎn)錄引物和莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物，同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄。