寫在前面

????????今天推薦的是由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院在2019年1月29日發(fā)表于International Journal of Biological Sciences（2020IF：6.58，JCRQ1）的一篇文章，通訊作者是Ying ying Lin教授，研究表明USP17通過去泛素化AEP抑制腫瘤發(fā)生和腫瘤生長。

研究背景

????????泛素特異性蛋白酶17(USP17)是去泛素酶的新成員，據(jù)報道在幾種實體瘤中發(fā)揮重要作用。然而，USP17在乳腺癌腫瘤發(fā)生中的表達(dá)和功能仍然不明確。

摘要部分

????????在這里作者發(fā)現(xiàn)乳腺癌組織中USP17的mRNA水平低于正常組織。同時，與惡性細(xì)胞系MDA-MB-231相比，在正常上皮細(xì)胞MCF-10A和MCF-7中檢測到更高的USP17水平。在MCF7細(xì)胞中抑制USP17增強了腫瘤發(fā)生和腫瘤生長，而USP17在惡性MDA-MB-231細(xì)胞中的過度表達(dá)降低了其體外和體內(nèi)的腫瘤發(fā)生和生長能力。進一步的研究表明,USP17與天冬酰胺內(nèi)肽酶(AEP)相互作用并去泛素化，導(dǎo)致AEP的蛋白質(zhì)水平降低。此外，AEP的敲低通過ERK信號的失活在體外和體內(nèi)抑制了乳腺癌腫瘤的發(fā)生和生長?？傊?，作者的研究表明USP17去泛素化AEP，下調(diào)其蛋白質(zhì)水平，并通過干擾ERK信號傳導(dǎo)抑制乳腺癌腫瘤發(fā)生。因此，作者的數(shù)據(jù)表明USP17是乳腺癌的潛在腫瘤抑制因子，而AEP是乳腺癌治療的有前景的靶標(biāo)。

研究內(nèi)容

1.USP17表達(dá)在乳腺癌中下調(diào)

????????首先，作者使用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析了USP17在1085例乳腺癌組織和291例正常乳腺組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明正常組織中的USP17 mRNA水平高于乳腺癌組織。使用來自UALCAN的TCGA數(shù)據(jù)獲得了類似的結(jié)果。此外，作者發(fā)現(xiàn)與正常組織相比，乳腺癌組織各個階段的USP17 mRNA表達(dá)均降低，這表明乳腺癌中USP17的表達(dá)與疾病進展階段呈負(fù)相關(guān)。此外，作者通過Broad-Novartis癌細(xì)胞系百科全書(CCLE)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)一組乳腺癌細(xì)胞系中的USP17 mRNA表達(dá)完全不同。接下來，作者檢測了USP17在不同惡性程度的不同乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)。有趣的是，USP17的mRNA和蛋白質(zhì)水平在MCF-10A和MCF-7中高于MDA-MB-231細(xì)胞（一種惡性乳腺癌細(xì)胞系）。

研究結(jié)論：USP17在乳腺癌腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。

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2.USP17表達(dá)的變化改變了乳腺癌細(xì)胞在體外和體內(nèi)的生長情況

????????為了研究USP17在乳腺癌中的功能，作者構(gòu)建了USP17過表達(dá)MDA-MB-231細(xì)胞系和USP17敲低MCF-7細(xì)胞系。然后，作者探究了USP17是否影響體外乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞生長能力。根據(jù)生長曲線結(jié)果，作者發(fā)現(xiàn)與對照細(xì)胞相比，MDA-MB-231中過表達(dá)的USP17顯著抑制細(xì)胞生長。相反，與對照細(xì)胞相比，USP17敲低顯著增強了細(xì)胞生長。接下來，作者評估了USP17對體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞致瘤性的影響。將USP17-OEMDA-MB-231細(xì)胞、USP17-KDMCF-7細(xì)胞及其對照細(xì)胞注射到BALB/c裸鼠脂肪墊中。經(jīng)過4周，USP17-OEMDA-MB-231細(xì)胞顯示出降低的腫瘤生長能力，而MCF-7-KD細(xì)胞具有明顯更高的致瘤性。

研究結(jié)論：USP17在乳腺癌細(xì)胞中具有腫瘤抑制功能。

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3.USP17與AEP相互作用并使其去泛素化

????????AEP可以被TRAF6泛素化并被USP17去泛素化。為了進一步研究USP17對AEP的調(diào)節(jié)，作者進行了免疫共沉淀(IP)分析以確認(rèn)AEP和USP17的相互作用。將編碼AEP、Flag標(biāo)記的TRAF6和Flag標(biāo)記的USP17的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。然后用AEP抗體免疫沉淀細(xì)胞裂解物。蛋白質(zhì)印跡分析顯示TRAF6和USP17均存在于AEP復(fù)合物中。隨后通過尺寸排阻色譜法發(fā)現(xiàn)，AEP、USP17和TRAF6出現(xiàn)在同一復(fù)合物中。此外，免疫熒光染色分析顯示AEP和USP17共定位于細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)區(qū)域?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明AEP與USP17相互作用。為了確定USP17的去泛素化功能，作者將編碼AEP、泛素(Ub)、TRAF6、USP17和USP17-C89S的表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。用蛋白酶體抑制劑MG132處理后，細(xì)胞裂解物用AEP抗體免疫沉淀。TRAF6過表達(dá)顯著增加了AEP泛素化水平，而USP17（而不是無活性突變體USP17 C89S）的過表達(dá)顯著減弱了AEP泛素化。

研究結(jié)論：AEP和USP17之間具有相互作用，USP17從AEP中去除泛素鏈。

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4.USP17下調(diào)AEP蛋白水平

????????先前研究表明RAF6可以增加AEP的穩(wěn)定性和分泌，作者想探究USP17是否調(diào)節(jié)AEP的穩(wěn)定性和分泌。用TRAF6、USP17和USP17 C89S轉(zhuǎn)染編碼AEP的質(zhì)粒后，作者分析了AEP的表達(dá)水平。TRAF6過表達(dá)顯著提高了pro-AEP和活性AEP水平，而USP17過表達(dá)降低了兩種形式的AEP表達(dá)。有趣的是，USP17突變質(zhì)粒C89S對降低AEP蛋白水平?jīng)]有影響。作者用Flag-USP17表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞并通過蛋白質(zhì)印跡分析。結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞中表達(dá)更多的USP17，AEP表達(dá)逐漸降低。由于成熟的AEP可以分泌到培養(yǎng)基中，為了探索USP17對AEP分泌的調(diào)節(jié)，作者檢測了來自USP17-OEMDA-MB-231和對照細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)基中的AEP水平。蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示當(dāng)USP17過表達(dá)時AEP分泌顯著減少。為了確定USP17對AEP穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)依賴于其去泛素化酶活性，作者進行了q-RT-PCR測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)USP17和C89S突變體的過表達(dá)都不影響AEP mRNA水平。一致地，USP17敲低幾乎沒有改變AEP mRNA水平。

研究結(jié)論：USP17下調(diào)了翻譯后途徑中的AEP蛋白水平。

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5.在體外和體內(nèi)抑制AEP可減少腫瘤發(fā)生和腫瘤生長

????????AEP參與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移進程。最近，有研究報道核質(zhì)鈣通過AEP調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖。為了進一步研究USP17是否通過下調(diào)AEP抑制乳腺癌腫瘤發(fā)生，作者在MDA-MB-231細(xì)胞系中構(gòu)建了AEP敲低穩(wěn)定的乳腺癌細(xì)胞系。AEP敲低細(xì)胞中的pro-AEP顯著降低。并且AEP的敲低顯著降低了體外細(xì)胞生長。此外，使用含有不同AEP蛋白濃度的培養(yǎng)基處理MDA-MB-231細(xì)胞，作者發(fā)現(xiàn)含有較高AEP蛋白濃度的上清液顯著促進了MDA-MB-231細(xì)胞體外生長。細(xì)胞周期分析也表明，在AEP沉默的細(xì)胞中，G2/M中的細(xì)胞比例顯著減少。此外，作者將AEP KD和含有綠色熒光蛋白（GFP）的對照MDA-MB-231細(xì)胞接種到裸鼠脂肪墊中，以研究AEP在原位乳腺癌模型中的作用。與對照組相比，接種AEP敲低細(xì)胞的小鼠的腫瘤形成率和腫瘤體積要低得多。此外，作者進行了回補實驗以確認(rèn)USP17和AEP在體內(nèi)乳腺癌腫瘤發(fā)生中的功能。由USP17過表達(dá)引起的腫瘤生長顯著減少可以通過AEP過表達(dá)來恢復(fù)。

研究結(jié)論：AEP在腫瘤發(fā)生和腫瘤生長中起重要作用，USP17通過下調(diào)AEP水平抑制乳腺癌增殖。

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6.USP17抑制AEP介導(dǎo)的ERK信號激活

????????為了確定USP17和AEP如何調(diào)節(jié)乳腺癌的增殖，作者探究了AEP蛋白處理的MDA-MB-231細(xì)胞中的幾個重要信號通路。Western blot檢測表明，在AEP刺激后，p-ERK，但不是總ERK，急劇增加。同時，USP17過表達(dá)和AEP敲低都導(dǎo)致p-ERK水平下降。因此，作者的結(jié)果表明，AEP通過激活ERK信號促進乳腺癌，而USP17通過下調(diào)AEP蛋白水平抑制乳腺癌的增殖。

研究結(jié)論：作者表征了USP17的腫瘤抑制功能和AEP在乳腺癌細(xì)胞中的腫瘤促進功能。USP17通過去泛素化并增強AEP轉(zhuǎn)換來抑制乳腺癌增殖。此外，AEP促進乳腺癌細(xì)胞增殖部分依賴于ERK信號的激活，而USP17的功能是破壞這一過程。

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結(jié)論與討論

????????總之，作者的數(shù)據(jù)表明USP17在乳腺癌樣本和細(xì)胞系中被下調(diào)。USP17通過去泛素化AEP并維持AEP蛋白水平,在體內(nèi)和體外抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和增殖。在正常細(xì)胞中，由于USP17水平高，AEP蛋白維持在低水平。然而，在USP17下調(diào)后，AEP在乳腺癌細(xì)胞中過度表達(dá)。

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Thank you!

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原文鏈接：https://www.ijbs.com/v15p0738.htm