乳腺癌常被稱為“粉紅殺手”，其發(fā)病率位居女性惡性腫瘤的首位。發(fā)生肺轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的重要原因，而乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生與壓力、肥胖、吸煙等多種因素引起的慢性炎癥密切相關(guān)，同時，腫瘤患者免疫防御能力減弱導(dǎo)致其容易遭受由病原菌引起的慢性肺部感染。因此，研究病原菌引起的慢性炎癥與乳腺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系是對乳腺癌治療極其重要的。

2023年8月11日，四川大學(xué)華西醫(yī)院周西坤研究員課題組、四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院李敬研究員課題組和中國科學(xué)院大學(xué)溫州研究院吳敏教授課題組共同合作在《Signal Transduction and Targeted Therapy》（IF=39.3）發(fā)表了題為“Chronic pulmonary bacterial infection facilitates breast cancer lung metastasis by recruiting tumor-promoting MHCIIhi neutrophils”的研究論文，該研究首次證實慢性肺部細菌感染能促進乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移進程，并鑒定到一群名為MHCIIhi的中性粒細胞亞群在促進乳腺癌轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮著重要作用，結(jié)果表明，MHCIIhi中性粒細胞可能是肺轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點。值得注意的是，本研究中用于構(gòu)建螢火蟲熒光素酶基因（firefly luciferase）4T1細胞穩(wěn)定株（4T1-luc）的慢病毒由漢恒生物提供。

下面我們一起來看看研究結(jié)果：

為了評估慢性肺部感染與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移之間的關(guān)聯(lián)，作者首先通過原位注射4T1-luc細胞建立小鼠腫瘤模型，隨后在成瘤后接受瓊脂珠包埋PAO1（銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株）的氣管內(nèi)滴注，與對照組（CTRL組）相比，慢性感染PAO1的小鼠（以下稱CI組）死亡率顯著增加且肺重明顯增高，肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)量也顯著增多，H&E染色顯示，CI組小鼠腫瘤負荷更強，但是兩組小鼠原位腫瘤的重量和體積并無統(tǒng)計學(xué)差異。同樣，在MMTV-PyMT自發(fā)乳腺癌小鼠模型中，由PAO1引起的慢性肺部感染增加了小鼠的肺重并促進了乳腺癌向肺的轉(zhuǎn)移和定植，而不影響原位腫瘤的重量。

圖1. 肺部慢性銅綠假單胞菌感染促進乳腺癌肺轉(zhuǎn)移

接下來，作者檢測了CI組和CTRL組小鼠的肺組織中免疫亞群的差異，將兩組小鼠的肺細胞進行了質(zhì)譜流式檢測（CyTOF），并生成了包括T細胞、B細胞、NK細胞、骨髓細胞在內(nèi)的單細胞免疫圖譜，結(jié)果顯示，CI組中所有這些細胞的比例略小于CTRL組。對淋巴細胞的聚類分析結(jié)果顯示，與CTRL組相比，肺中CI組的CD3+T細胞表達更高水平的PD-1。隨后作者又提取了髓系標(biāo)志物進行聚類分析，在髓系譜系中，與CTRL組相比，除中性粒細胞降低外，M2巨噬細胞的數(shù)量和比例顯著增加。因此，作者接下來將研究重點放在了中性粒細胞上。

圖2. CyTOF分析慢性細菌感染的肺組織中的免疫細胞

中性粒細胞已被證明可以在不同的環(huán)境條件下促進或抑制乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移。最近有研究表明，中性粒細胞是異質(zhì)的，但中性粒細胞亞型的類別和功能比其他免疫細胞的研究要少得多。中性粒細胞的聚類分析表明，小鼠肺組織中至少有6個中性粒細胞亞型群，包括：MHCIIhi中性粒細胞、Ly6C 中性粒細胞、CD62Lhi中性粒細胞、 Siglec_Fhi 中性粒細胞、Ly6Clow 中性粒細胞和其他中性粒細胞亞群。作者通過CyTOF分析顯示，MHCIIhi中性粒細胞在CI組的肺中的存在比例高于CTRL組，流式細胞術(shù)結(jié)果表明，肺部慢性感染PAO1促進了MHCIIhi的積累。然后作者分析了MHCIIhi中性粒細胞在模型小鼠肺部的位置，免疫熒光染色顯示MHCIIhi中性粒細胞出現(xiàn)在腫瘤結(jié)節(jié)的外圍，患者樣本的免疫熒光分析也證實MHCIIhi中性粒細胞分布在腫瘤的外圍和內(nèi)部。這些結(jié)果表明，MHCIIhi中性粒細胞可能在乳腺癌向肺部轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

圖3. 乳腺癌小鼠肺組織MHCIIhi中性粒細胞的鑒定

為了進一步了解中性粒細胞亞群的作用，作者探究了MHCIIhi中性粒細胞是否表現(xiàn)出促瘤特性。作者對從慢性感染PAO1的乳腺癌小鼠分離的MHCIIhi中性粒細胞和MHCIIlow中性粒細胞進行了RNA測序，并使用GO和Reactome富集分析差異表達的基因，血管生成相關(guān)途徑的上調(diào)表明，MHCIIhi中性粒細胞可能促進血管生成以支持腫瘤細胞生長，而且許多與腫瘤促進過程相關(guān)的基因在MHCIIhi中性粒細胞中高度表達。這些結(jié)果表明，MHCIIhi中性粒細胞可能重塑肺部微環(huán)境，以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。

為了評估MHCIIhi中性粒細胞與MHCIIlow中性粒細胞的功能，作者通過流式分選從荷瘤小鼠中分離出中性粒細胞，通過Transwell實驗表明，MHCIIhi和MHCIIlow中性粒細胞都可以促進腫瘤細胞遷移和侵襲，且MHCIIhi中性粒細胞對腫瘤遷移的影響更大。RNA-seq和流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，MHCIIhi和MHCIIlow中性粒細胞都高表達ROS相關(guān)基因，而MHCIIhi中性粒細胞比MHCIIlow中性粒細胞產(chǎn)生更多的ROS，然后作者檢測發(fā)現(xiàn)MHCIIhi比MHCIIlow具有更強的釋放中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)（NETs）的能力。這些發(fā)現(xiàn)表明，與MHCIIlow中性粒細胞相比，MHCIIhi中性粒細胞具有直接和間接的促瘤功能。

接下來，作者驗證了MHCIIhi中性粒細胞是否在體內(nèi)表現(xiàn)出促瘤功能。為此，作者從慢性感染了PAO1的乳腺癌小鼠的肺中分離出的MHCIIhi和MHCIIlow中性粒細胞，在4T1細胞接種小鼠后的第11、14、17天將中性粒細胞輸送到肺中，第21天處死小鼠，發(fā)現(xiàn)與其他組相比，MHCIIhi組的轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)數(shù)量顯著增加。

圖4. MHCIIhi中性粒細胞在體內(nèi)和體外均表現(xiàn)出促瘤作用

?為了進一步探索MHCIIhi中性粒細胞在肺中聚積的機制，作者分析了未感染和慢性感染細菌小鼠肺組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)許多趨化因子在慢性細菌感染的小鼠中高度上調(diào)。眾所周知，趨化因子CCL2可以招募巨噬細胞，還可以在炎癥狀態(tài)下通過CCL2-CCR2信號通路招募中性粒細胞。所以，作者研究了CCL2是否參與了MHCIIhi中性粒細胞的招募。作者在慢性細菌感染小鼠的肺組織和外周血中檢測到CCL2的表達水平升高，而且與MHCIIlow中性粒細胞相比，MHCIIhi中性粒細胞表達更高水平的Ccr2。隨后，作者評估了CCL2在體外招募MHCIIhi中性粒細胞的能力，流式細胞熒光分選技術(shù)（FACS）結(jié)果顯示，用CCL2誘導(dǎo)后，MHCIIhi中性粒細胞在總中性粒細胞部分中的比例顯著增加。同時，作者探究了CCL2是否在體內(nèi)招募MHCIIhi中性粒細胞，在荷瘤小鼠模型被細菌慢性感染后，將CCL2中和抗體或IgG滴入肺中，F(xiàn)ACS分析評估小鼠肺中MHCIIhi中性粒細胞的比例和數(shù)量，結(jié)果顯示，CCL2中和抗體顯著抑制MHCIIhi中性粒細胞向肺的遷移，而且與IgG組相比，CCL2中和抗體組的轉(zhuǎn)移性肺結(jié)節(jié)數(shù)量顯著減少?？傊?，這些結(jié)果表明，肺中的慢性細菌感染上調(diào)了CCL2的表達，反過來，CCL2可以部分地將MHCIIhi中性粒細胞募集到肺中，以促進癌癥的肺轉(zhuǎn)移。

圖5. 慢性肺部細菌感染來源的CCL2將MHCIIhi中性粒細胞招募到肺部

綜上所述，該研究發(fā)現(xiàn)慢性肺部細菌感染可以顯著促進乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移，其作用機制是慢性炎癥升高肺部CCL2的含量，CCL2遷移到外周血中并募集具有促瘤作用的MHCIIhi中性粒細胞至肺組織中，而高聚積的MHCIIhi中性粒細胞促進了乳腺癌向肺部的轉(zhuǎn)移以及腫瘤細胞的定植。相關(guān)數(shù)據(jù)不僅提升了慢性炎癥在促瘤作用中的認識，還發(fā)現(xiàn)了一群新定義的促瘤中性粒細胞亞群，為中性粒細胞的異質(zhì)性研究提供了新證據(jù)，更可為腫瘤免疫治療提供新思路及理論依據(jù)。

圖6. 慢性肺部細菌感染誘導(dǎo)肺轉(zhuǎn)移的機制示意圖