Establishment of a Risk Signature Based on m6A RNA Methylation Regulators That Predicts Poor Prognosis in Renal Cell Carcinoma

Abstract

目的

N6-甲基腺苷 (m6A) 修飾是最常見的甲基化修飾之一，它們由 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子介導(dǎo)。然而，它們?cè)谀I細(xì)胞癌 (RCC) 中的作用尚不完全清楚。本研究的目的是調(diào)查監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì) RCC 的影響。

材料和方法

檢測 RCC 中 13 個(gè)主要 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平，并進(jìn)行共識(shí)聚類以探索它們與 RCC 的關(guān)系。此后，建立了基于監(jiān)管機(jī)構(gòu)的風(fēng)險(xiǎn)簽名。通過使用兩個(gè)數(shù)據(jù)集（癌癥基因組圖譜 [TCGA] 和基因表達(dá)綜合 [GEO] 數(shù)據(jù)集）和 ROC 曲線分析進(jìn)行預(yù)后分析，該風(fēng)險(xiǎn)模型得到了充分驗(yàn)證。

結(jié)果

與 TCGA 數(shù)據(jù)庫中的 128 名正常對(duì)照相比，在 13 種主要 m6A 調(diào)節(jié)劑中，893 例 RCC 病例中有 6 種顯著上調(diào)，4 種顯著下調(diào)?；诒O(jiān)管機(jī)構(gòu)的共識(shí)聚類確定了兩個(gè) RCC 病例集群，它們與病理特征（T 狀態(tài)）顯著相關(guān)。因此，這些結(jié)果表明 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子與 RCC 相關(guān)。此后，建立了涉及兩個(gè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)（METTL14 和 WTAP）的風(fēng)險(xiǎn)模型。基于人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)和 RCC 和正常細(xì)胞系中的實(shí)時(shí) PCR 進(jìn)一步證實(shí)了這兩種調(diào)節(jié)劑的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的變化。結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)模型可以作為總生存期的獨(dú)立預(yù)后標(biāo)志物，

結(jié)論

總的來說，本研究的結(jié)果表明風(fēng)險(xiǎn)模型（基于兩個(gè) m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子）可以作為 RCC 的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，這可能有助于進(jìn)一步研究 RCC 中的 m6A RNA 修飾。

關(guān)鍵詞：腎細(xì)胞癌，m6A甲基化，TCGA，預(yù)后特征

結(jié)果

m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子在 RCC 中的表達(dá)

m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子在各種腫瘤的形成和發(fā)展中起關(guān)鍵作用。首先，這些調(diào)節(jié)劑的表達(dá)水平（表格1) 比較了從 TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲得的 893 個(gè) RCC 和 128 個(gè)正常組織。在 13 個(gè)基因中，有 10 個(gè)基因表現(xiàn)出顯著差異。與正常對(duì)照相比，RCC 患者的 6 個(gè)基因（METTL3、RBM15、YTHDF1、YTHDC2、ALKBH5 和 FTO）顯著上調(diào)，4 個(gè)基因（METTL14、ZC3H13、HNRNPC 和 YTHDF2）顯著下調(diào)。圖 1A和和 B)。乙）。此外，13 個(gè)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平呈正相關(guān)（圖 1C）。

通過共識(shí)聚類分析識(shí)別兩個(gè) RCC 病例集群

ConsensusClusterPlus 軟件包用于根據(jù) TCGA 數(shù)據(jù)庫中 893 個(gè) RCC 組織中 13 個(gè) m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平進(jìn)行共識(shí)聚類分析。結(jié)果表明，當(dāng)k=3時(shí)，累積分布函數(shù)（CDF）曲線下面積的相對(duì)變化明顯減?。▓D 2A和和 B)。乙）。然而，共識(shí)矩陣表明，當(dāng)將病例分為三個(gè)集群時(shí)，集群之間存在相當(dāng)大的分類重疊。因此，案件被分為兩組（圖 2C）。對(duì)于 k = 2-9，RCC 病例的分布呈現(xiàn)在圖 2D.?兩個(gè)聚類的主成分分析用于評(píng)估分類的性能。結(jié)果表明，集群 1 病例聚集在一起，集群 2 病例也聚集在一起（圖 2E）。

集群 1 和 2 與 RCC 的臨床病理學(xué)特征（T 狀態(tài)）相關(guān)

為了進(jìn)一步了解聚類結(jié)果，對(duì)兩個(gè)聚類中 634 名 RCC 患者的總生存期進(jìn)行了 Kaplan-Meier 分析。結(jié)果表明，與集群1相比，集群2的預(yù)后更差，但差異不顯著（P=0.084；圖 3A）。此外，這些集群與 T 狀態(tài)顯著相關(guān)（圖 3B）。總的來說，結(jié)果表明這些集群與 RCC 密切相關(guān)。

基于 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)劑的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型

隨后，評(píng)估了 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平與 RCC 患者預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。根據(jù) TCGA 數(shù)據(jù)庫中調(diào)節(jié)因子的表達(dá)水平進(jìn)行單變量 Cox 回歸分析。結(jié)果表明，WTAP（風(fēng)險(xiǎn)比 [HR]，1.051；95% 置信區(qū)間 [CI]，1.021–1.082），HNRNPC（HR，1.016；95% CI，1.003–1.028），METTL3（HR，1.086；95% CI，1.017–1.161）、YTHDC1（HR，0.955；95% CI，0.90–0.98）和 METTL14（HR，0.730；95% CI，0.638–0.836）與總生存期顯著相關(guān)（圖 4A）。

此后，選擇了TCGA數(shù)據(jù)單變量分析中P<0.001的兩個(gè)基因（METTL14和WTAP），隨后應(yīng)用LASSO Cox回歸算法。通過最低標(biāo)準(zhǔn)選擇這兩個(gè)基因作為風(fēng)險(xiǎn)特征。然后使用從 LASSO 算法獲得的系數(shù)確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（圖 4B和和 C)。C）。然后根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。

風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與 RCC 的臨床病理學(xué)特征相關(guān)

為了進(jìn)一步分析風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與 RCC 患者臨床特征之間的關(guān)聯(lián)，評(píng)估了高/低風(fēng)險(xiǎn)組與總生存期和各種臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)聯(lián)。首先，結(jié)果表明，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組的總生存期更差（圖 5A）。其次，確定了高/低風(fēng)險(xiǎn)組與臨床病理特征之間的關(guān)聯(lián)，包括 TNM 狀態(tài)、分期和性別。表 2），并確定了高/低風(fēng)險(xiǎn)組與 M 狀態(tài)、T 狀態(tài)、階段和性別之間的強(qiáng)關(guān)聯(lián)（圖 5C）。結(jié)果還表明，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，WTAP 下調(diào)，而 METTL14 在高風(fēng)險(xiǎn)組中上調(diào)。

ROC 曲線分析用于進(jìn)一步驗(yàn)證風(fēng)險(xiǎn)簽名的預(yù)測性能。ROC 曲線下面積為 0.701 (圖 5B)，這表明該模型具有較高的預(yù)測性能。

基因表達(dá)綜合 (GEO) 數(shù)據(jù)集中的驗(yàn)證

GSE29609 GEO 數(shù)據(jù)集（涉及 39名RCC 患者）用于進(jìn)一步驗(yàn)證 RCC 患者風(fēng)險(xiǎn)特征的預(yù)后價(jià)值。根據(jù)中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，將 39 名患者分為高危組和低危組。結(jié)果表明，高危組患者的預(yù)后明顯低于低危組患者（P<0.05；圖 6）。結(jié)果與TCGA結(jié)果一致，表明風(fēng)險(xiǎn)模型準(zhǔn)確有效。

Cox 回歸分析表明風(fēng)險(xiǎn)特征是一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)

單變量 (圖 7A) 和多變量 (圖 7B) Cox 回歸分析表明臨床病理學(xué)特征（包括風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分）與總生存期之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，年齡、分期和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與 RCC 的總生存期顯著相關(guān)。圖 7A和和 B)。乙）?？偟膩碚f，這些結(jié)果表明，從風(fēng)險(xiǎn)特征中獲得的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分可以作為 RCC 患者總體生存率的獨(dú)立預(yù)后因素。

驗(yàn)證兩種 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)劑的 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)水平

為了進(jìn)一步驗(yàn)證我們的結(jié)果，來自人類蛋白質(zhì)圖譜 (HPA) 數(shù)據(jù)庫的信息用于分析兩種 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子的蛋白質(zhì)表達(dá)：METTL14 和 WTAP。METTL14 在 RCC 組織中的蛋白表達(dá)高于正常組織（圖 8A），而WTAP在正常組織中的蛋白表達(dá)高于RCC組織（圖 8B）。這些結(jié)果與 METTL14 和 WTAP 在 mRNA 水平的表達(dá)一致（圖 8C和D);D);?我們的結(jié)果顯示，與對(duì)照腎細(xì)胞系（293T）相比，RCC 細(xì)胞系（786-0 和 769-P）中的 METTL14 mRNA 顯著降低，而 RCC 細(xì)胞系（786-0 和卡基-1)。這些結(jié)果表明 METTL14 和 WTAP 在 RCC 的 mRNA 和蛋白質(zhì)水平上均表現(xiàn)出顯著變化，表明它們?cè)?RCC 中具有重要作用。

討論

大多數(shù) RCC 病例是透明細(xì)胞 RCC。3早期腎細(xì)胞癌患者無明顯癥狀，部分患者在病理診斷時(shí)已發(fā)生轉(zhuǎn)移。分子靶向治療容易產(chǎn)生耐藥性。RCC患者通常預(yù)后不良，5年生存率<40%。25基于干擾素和白細(xì)胞介素 2 的免疫療法作為一線治療，有 15% 的療效。26?RCC 的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的過程，涉及許多因素，如吸煙、肥胖、遺傳和細(xì)胞周期變化。27因此，RCC 背后的精確機(jī)制是復(fù)雜的?；谶@些機(jī)制開發(fā)新的治療策略至關(guān)重要。

RNA 的 m6A 修飾是指在甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，腺嘌呤 (A) 的第 6 位氮原子發(fā)生甲基化。28每個(gè) mRNA 有 3-5 個(gè) m6A 甲基化位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié) RNA 穩(wěn)定性、定位、運(yùn)輸、剪接和翻譯。29越來越多的證據(jù)表明 m6A 修飾在急性髓性白血病 (AML)、肝細(xì)胞癌 (HCC)、乳腺癌和其他類型的癌癥中的作用。在惡性腫瘤中，m6A修飾可以誘導(dǎo)致癌或抗癌作用。然而，關(guān)于 m6A 甲基化調(diào)節(jié)因子在 RCC 中的作用知之甚少。本研究中涉及 RCC 中 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子的風(fēng)險(xiǎn)模型為進(jìn)一步研究 RCC 提供了新的見解。

根據(jù)本研究中分析的 893 個(gè) RCC 和 128 個(gè)正常組織，與正常對(duì)照組相比，RCC 患者中 13 個(gè) m6A RNA 甲基化基因的表達(dá)發(fā)生了顯著改變，這表明 m6A RNA 修飾可能在 RCC 中起作用。在13個(gè)監(jiān)管機(jī)構(gòu)中，F(xiàn)TO表達(dá)的變化最為顯著。FTO 是非血紅素 Fe (II) 和 α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶 ALKB 蛋白家族的成員。30最近的研究表明，F(xiàn)TO 表達(dá)可能與幾種腫瘤有關(guān)，例如乳腺癌、甲狀腺癌、子宮內(nèi)膜癌和胃癌。31、32?Li 等人報(bào)道，F(xiàn)TO 通過降低 ASB2 和 RARA 靶基因中的 m6A 水平來影響白血病的發(fā)生和耐藥性。33Zhou等證實(shí)宮頸鱗狀細(xì)胞癌（CSCC）患者FTO表達(dá)明顯升高，F(xiàn)TO和β-catenin表達(dá)在CSCC中具有預(yù)后價(jià)值。34上述這些研究調(diào)查了癌癥發(fā)展過程中 FTO 誘導(dǎo)的 m6A 修飾的生物分子機(jī)制，但還需要進(jìn)一步研究。

為了進(jìn)一步研究 13 m6A 調(diào)節(jié)劑對(duì) RCC 臨床特征和預(yù)后的影響，從 TCGA 數(shù)據(jù)庫下載臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。進(jìn)行共識(shí)聚類以將 RCC 病例分為兩個(gè)集群。結(jié)果表明，這些簇與 RCC 的臨床病理學(xué)特征（T 狀態(tài)）相關(guān)。結(jié)果還表明，m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子的表達(dá)在兩個(gè)簇之間存在差異。因此，該分析表明 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子與 RCC 密切相關(guān)。

通過進(jìn)行單變量 Cox 回歸分析，進(jìn)一步研究了 m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子與 RCC 預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)。根據(jù)結(jié)果，選擇 P<0.01 的兩個(gè) m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)因子（METTL14 和 WTAP）進(jìn)行 LASSO Cox 回歸分析以建立風(fēng)險(xiǎn)特征。此外，基于熱圖，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組的 METTL14 上調(diào)和 WTAP 下調(diào)。雖然 METTL14 和 WTAP 都是作家，但它們?cè)谀[瘤中的表達(dá)水平和作用并不相同。WTAP 在促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展的 AML 中上調(diào)。相比之下，METTL14 在 HCC 中下調(diào)，具有抑制作用。35?,?36每個(gè) m6A RNA 甲基化調(diào)節(jié)劑在不同腫瘤中的作用不同。例如，METTL3 在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中下調(diào)并具有抑制作用，但在肺癌和 HCC 中上調(diào)。37-39?METTL14 和 WTAP 在 RCC 中的作用尚未完全了解，需要進(jìn)一步研究。

我們的結(jié)果表明，高/低風(fēng)險(xiǎn)組（基于中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分）與 RCC 預(yù)后顯著相關(guān)。此外，風(fēng)險(xiǎn)特征的ROC曲線下面積為0.701，表明模型的預(yù)測性能良好。此外，高/低風(fēng)險(xiǎn)組與臨床病理學(xué)特征相關(guān)（P<0.05；T 狀態(tài)、M 狀態(tài)、分期和性別）。最后，進(jìn)行單變量和多變量 Cox 回歸分析以評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（和其他臨床病理學(xué)特征）與總生存期之間的關(guān)聯(lián)。結(jié)果表明，風(fēng)險(xiǎn)特征可能作為 RCC 的獨(dú)立預(yù)后因素。因此，WTAP 和 METTL14 可作為 RCC 的獨(dú)立預(yù)后因素。

WTAP 是 m6A 甲基化修飾40中的必需蛋白，因?yàn)樗鼌f(xié)調(diào) METTL3-METTL14 異二聚體定位并促進(jìn) m6A 甲基化。16這表明 WTAP 的致癌作用可能與 m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物密切相關(guān)。此外，WTAP 與其他癌癥的發(fā)展有關(guān)。發(fā)現(xiàn) WTAP 表達(dá)在胰腺導(dǎo)管腺癌 (PDAC) 中顯著增加，并且是 PDAC 中的獨(dú)立預(yù)后因素。41?WTAP 可能通過調(diào)節(jié) CDK2 mRNA 的穩(wěn)定性影響 RCC 細(xì)胞增殖，從而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生和發(fā)展。41因此，WTAP 可作為 RCC 診斷和治療的新靶點(diǎn)。

METTL14 是 m6A 甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的重要組成部分。15最近的研究報(bào)告了它在腫瘤惡性表型中的作用。一項(xiàng)研究表明，在 AML 細(xì)胞系中敲除 METTL14 可有效抑制增殖。42此外，METTL14 和 FTO 在 HCC 中下調(diào)，36這表明 m6A 修飾涉及復(fù)雜的反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，涉及寫入器和擦除器。迄今為止，很少有研究調(diào)查 METTL14 在 RCC 中的作用。該研究表明，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，METTL14 在高風(fēng)險(xiǎn)組中上調(diào)，這表明 METTL14 上調(diào)與 RCC 預(yù)后不良有關(guān)。

m6A 甲基化調(diào)節(jié)因子的具體調(diào)節(jié)及其潛在的生物學(xué)功能需要進(jìn)一步研究，特別是關(guān)于本研究風(fēng)險(xiǎn)特征中包含的兩個(gè) m6A 基因（編碼寫入者）。