1 前言說明

酶切鑒定：提純重組質(zhì)粒，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶（一種或兩種）切割質(zhì)粒釋放出的插入片斷，對于可能存在雙向插入的重組子還可用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶消化鑒定插入方向，然后用凝膠電泳檢測插入片斷和載體的大小。

酶切連接：

2 酶切鑒定

2.1實驗操作程序

2.1.1酶切操作：

以酶切and連接方式構(gòu)建質(zhì)粒：目的質(zhì)粒，使用Bam H1和Xba I兩種酶進行反應(yīng)，目的：獲得局部片段

酶切反應(yīng)體系（冰水浴條件）：

配置OK體系，放置37℃恒溫箱，2h,然后4℃過夜

2.1.2瓊脂糖凝膠電泳分離目的DNA：

材料：1 x TAE；瓊脂糖；EB，Mark（5-10ul），Buffer（50ul+10ulBuffer）

1.按照相應(yīng)配置體系，稱量并倒入取錐形瓶，加入1 x TAE溶解；

2.放在微波爐加熱至沸騰，兩次（第一次約45s，第二次約15s）

3.待稍涼后（切記不能凝固），加入EB，倒入卡槽里面（注意梳子插孔方向）

4.待凝固后，約15min，放入電泳槽（注意拔梳子要小心）。

5.電壓：11V，電流198mA，時間：45min

6.紫外光照射，切膠，用1.5ml離心管回收

7.加樣時注意膠孔方向，切勿搞反了

2.1.3目的基因（DNA）膠回收

1.將單一的目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下來（盡量切除多余部分）放入干凈的1.5ml離心管中，稱重。

2.向膠塊中加入等倍體積溶液的PN（如果凝膠重0.1g，其體積可視為100ul，則加入100ul PN溶液），放置在50℃金屬浴溶解，期間間隔3-5min上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解。

3.此時，向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管）加入500ul平衡液BL，12000rpm（~13400*g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

4.將溶解OK的膠溶液加入到吸附柱CA2（吸附柱放入收集管）中，室溫靜置2min,12000rpm（~13400*g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中

5.向吸附柱CA2中加入600ul漂洗液PW（使用前檢查是否已經(jīng)加入無水乙醇），12000rpm（~13400*g）離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CA2放入收集管中

6.重復(fù)上一步驟

7.將吸附柱CA2放入收集管中，12000rpm（~13400*g）離心2min，盡量除盡漂洗液，將吸附柱CA2置于室溫防止數(shù)分鐘，徹底晾干，以防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗

8.將吸附柱CA2放入新的離心管中，向吸附膜中間懸空加入30ul的ddH2O，室溫靜置2min，12000rpm（~13400*g）離心2min，收集DNA溶液

9.純度檢測

2.1.4酶連接實驗

酶連接反應(yīng)體系（冰水?。?/p>

配置OK體系，放置金屬水浴鍋（16℃）連接，過夜。

后續(xù)【質(zhì)粒轉(zhuǎn)化】【挑克隆】【搖菌】【中提】