細(xì)胞培養(yǎng)：

模擬體內(nèi)的生理環(huán)境，在無(wú)菌、適宜溫度和一定的營(yíng)養(yǎng)條件下，使離體細(xì)胞生存、生長(zhǎng)并維持結(jié)構(gòu)和功能的一門技術(shù)。包括細(xì)胞傳代、換液、凍存、復(fù)蘇幾個(gè)操作。

細(xì)胞傳代：

體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是平皿等容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，需要分離出一部分細(xì)胞和更新培養(yǎng)液，這一過程成為傳代。

貼壁細(xì)胞：

試劑：PBS、胰酶、含血清培養(yǎng)基

流程：

1.觀察：顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是否良好、細(xì)胞密度是否達(dá)到了80%-90%

2.廢棄液：倒掉細(xì)胞瓶里的培養(yǎng)液

3.清洗：用PBS清洗1-2次

4.消化：加入適量的胰酶進(jìn)行消化，在顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞收縮變圓，即可棄去胰酶（目的是切掉細(xì)胞與瓶壁、細(xì)胞與細(xì)胞間的黏連）

5.吹打：加入適宜含血清培養(yǎng)基，并用滴管按順序輕柔吹打，混勻細(xì)胞。（加培養(yǎng)基終止胰酶作用）

6.傳代比例：根據(jù)細(xì)胞的具體生長(zhǎng)情況，取合適的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。（加入傳代比例1:4，可以理解為細(xì)胞瓶里有4ml的細(xì)胞懸液，取了1ml到新的培養(yǎng)瓶進(jìn)行培養(yǎng)）

7.補(bǔ)充含血清培養(yǎng)基，做好標(biāo)記，放入孵箱培養(yǎng)

100%細(xì)胞密度：

80%細(xì)胞密度

70%細(xì)胞密度

40%細(xì)胞密度

細(xì)胞換液：

通過換液清除掉細(xì)胞在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生的代謝廢物，補(bǔ)充新鮮的含血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)。

試劑：PBS、含血清培養(yǎng)基

流程：

1.棄液：棄去細(xì)胞瓶中的培養(yǎng)液

2.清洗：用PBS清洗1-2次

3.加液：添加新鮮的含血清培養(yǎng)基

4.培養(yǎng)：放入孵箱培養(yǎng)

細(xì)胞凍存：

將細(xì)胞放在低溫環(huán)境，減少細(xì)胞代謝，以便長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

試劑：凍存液、PBS、胰酶、含血清培養(yǎng)基

（凍存液：即含有DMSO二甲基亞砜和血清的溶液，DMSO的作用是放置在低溫零度以下至-196℃保存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)液冰晶形成、滲透壓改變、細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂等導(dǎo)致的損傷。 血清 的作用是為細(xì)胞提高營(yíng)養(yǎng)。DMSO和血清互溶時(shí)會(huì)散發(fā)熱量，所以凍存液需要提前制備）

凍存液的配方不是固定的。

①血清：DMSO=9:1

②含血清培養(yǎng)基（血清濃度為10%-20%）：DMSO=9:1

③含血清培養(yǎng)基（血清濃度為10%-20%）：血清：DMSO=7:2:1

流程：

1.觀察：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞

2.廢棄液：倒掉細(xì)胞瓶里的培養(yǎng)液

3.清洗：用PBS清洗1-2次

4.消化：加入適量的胰酶進(jìn)行消化，在顯微鏡下觀察到大部分細(xì)胞收縮變圓，即可棄去胰酶（目的是切掉細(xì)胞與瓶壁、細(xì)胞與細(xì)胞間的黏連）

5.吹打：加入適宜含血清培養(yǎng)基，并用滴管按順序輕柔吹打，混勻細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液

6.離心：1000r/min離心5min棄上清液

7.凍存：加入凍存液，輕輕吹吸均勻，按每管1ml的量，裝入凍存管，4℃冰箱內(nèi)20min，轉(zhuǎn)入20℃冰箱30min，-80℃過夜，最后放入液氮罐中（不是直接將凍存管放進(jìn)去）

兩種凍存方法：

①傳統(tǒng)凍存法：先放入4℃冰箱內(nèi)20min，之后轉(zhuǎn)入-20℃冰箱30min，再-80℃冰箱過夜，最后放入液氮罐中保存。

②程序降溫凍存法：將凍存管轉(zhuǎn)移至細(xì)胞漸凍盒后放于-80℃冰箱過夜，再轉(zhuǎn)移至液氮長(zhǎng)期保存。

細(xì)胞復(fù)蘇：

將凍存在液氮中的細(xì)胞解凍之后重新培養(yǎng)，細(xì)胞恢復(fù)生長(zhǎng)的過程。

試劑：含血清培養(yǎng)基

流程：

1.從液氮中取出凍存管，迅速置于37℃水浴中1min（不超過3min，解凍時(shí)，邊晃動(dòng)邊觀察，當(dāng)看到只有一小塊冰存在時(shí)，即可從水浴鍋中取出）

2.打開凍存管，迅速將細(xì)胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻、

3.1000r/min離心5min，棄去上清液

4.沉淀中加入適當(dāng)培養(yǎng)液，放入孵箱中培養(yǎng)。（復(fù)蘇的細(xì)胞需要在24h后換一次培養(yǎng)液）