近年來，細(xì)胞增殖一直是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。細(xì)胞增殖是指細(xì)胞在周期調(diào)控因子的作用下，通過DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等復(fù)雜反應(yīng)而進(jìn)行的分裂系列過程，其中核DNA的復(fù)制倍增是整個(gè)過程的重要特征。

細(xì)胞增殖檢測技術(shù)廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)、腫瘤生物學(xué)、藥理和藥代動力學(xué)等研究領(lǐng)域，不僅在研究細(xì)胞的基本生物學(xué)特征中非常重要，而且是分析細(xì)胞狀態(tài)、研究遺傳性狀的一種基本方法，可為探討疾病的發(fā)病機(jī)制、診斷疾病及治療疾病提供有價(jià)值的資料。

檢測細(xì)胞增殖的方法目前主要分為代謝活性檢測、DNA合成檢測、細(xì)胞增殖相關(guān)抗原檢測等。此外，還可以檢測ATP等酶活性、鈣離子內(nèi)流、細(xì)胞膜完整性等，每種檢測方法都存在各自的優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，盡量選擇準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好的檢測方法或?qū)⒍喾N檢測方法結(jié)合，從而客觀、全面地反映實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

???計(jì)數(shù)法

Part.1 直接計(jì)數(shù)法

儀器：血球計(jì)數(shù)板或細(xì)胞計(jì)數(shù)儀

優(yōu)點(diǎn)：簡單、成本低，可用于細(xì)胞生長曲線的繪制。

缺點(diǎn)：無法區(qū)分活細(xì)胞與死細(xì)胞，不適合數(shù)量較多或特定亞群的細(xì)胞計(jì)數(shù)。

Part.2 染料排斥法

由于細(xì)胞膜的選擇性，活細(xì)胞不允許伊紅、臺盼藍(lán)、苯胺黑、0.4% 錐蟲藍(lán)等透過，只有死細(xì)胞才會顯色。這種方法無法區(qū)分增殖細(xì)胞和非增殖細(xì)胞，只適合辨別細(xì)胞的基礎(chǔ)活性（活/死細(xì)胞）及其細(xì)胞膜的完整性。

???克隆形成

在克隆內(nèi)，細(xì)胞和細(xì)胞之間的連接比較緊密，一個(gè)細(xì)胞就能形成一個(gè)大的克隆。

克隆形成率反映細(xì)胞群體依賴性和增殖能力兩個(gè)重要性狀。

平皿克隆形成試驗(yàn)：適用于貼壁細(xì)胞， 如正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞；

軟瓊脂克隆形成試驗(yàn)：適用于腫瘤細(xì)胞、 轉(zhuǎn)化細(xì)胞和懸浮生長細(xì)胞；

不同的細(xì)胞克隆形成能力不同：原代培養(yǎng)的細(xì)胞克隆形成能力弱，可傳代的細(xì)胞系強(qiáng)；二倍體細(xì)胞克隆形成能力弱，轉(zhuǎn)化細(xì)胞系強(qiáng)；正常細(xì)胞弱，腫瘤細(xì)胞強(qiáng)。

克隆形成率 =（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）× 100%

???細(xì)胞代謝活性（比色法）

主要分為MTT/CCK-8/MTS三種方法，原理是利用細(xì)胞線粒體內(nèi)的酶將檢測試劑還原為有色產(chǎn)物，隨后測量相應(yīng)的OD值即可，其與細(xì)胞活性（數(shù)量）成正比。特別適用于高通量篩選和快速獲得結(jié)果。

Part.1 MTT

MTT中文名稱噻唑藍(lán)（淡黃色），可以被活細(xì)胞中線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素C等還原為不能溶于水的藍(lán)紫色產(chǎn)物甲臜（formazan），需進(jìn)一步使用DMSO等有機(jī)溶劑溶解后才能檢測。MTT通常適用于貼壁細(xì)胞的檢測，不適合懸浮細(xì)胞的檢測。

Part.2 CCK-8

使用的是WST-8，它在電子耦合試劑的作用下可以被活細(xì)胞線粒體內(nèi)的脫氫酶還原為高度水溶性的橙黃色甲臜，顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。CCK-8可直接加入細(xì)胞樣品中，因此適合懸浮細(xì)胞和貼壁細(xì)胞的檢測。對細(xì)胞幾乎沒有毒性, 檢測完成后的細(xì)胞還可以繼續(xù)培養(yǎng)使用。

???DNA合成檢測法

DNA的倍增是細(xì)胞在增殖過程中最顯著的變化之一。直接測定細(xì)胞的DNA合成含量，是檢測細(xì)胞增殖最精確的方法。最常用的方法使BrdU/EdU檢測法，應(yīng)用于細(xì)胞DNA修復(fù)，分化及細(xì)胞標(biāo)記物追蹤等方面。

Part.1 BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）

BrdU能夠代替正常的胸腺嘧啶參與細(xì)胞DNA復(fù)制過程，BrdU的特異性抗原可以用于檢測BrdU的摻入，從而判斷細(xì)胞的增殖能力。缺點(diǎn)是需要對雙鏈DNA進(jìn)行變性處理（酸變形、熱變性等）。

Part.2 EdU（5-乙炔基-2’-脫氧鳥苷）

是BrdU的替代方法，無需特殊條件處理（酸解、熱解等）。EdU是一種新型胸腺嘧啶核苷類似物，可以在DNA合成過程中替代胸腺嘧啶摻入到新合成的DNA中。通過點(diǎn)擊反應(yīng)，新合成的DNA會被相應(yīng)的熒光探針標(biāo)記，從而可以通過DNA的合成來反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況。

Part.3 3H-TdR

又稱為放射性核素標(biāo)記法，需要一定的設(shè)備，并且容易造成環(huán)境污染，需要特殊處理。胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的堿基，用同位素3H標(biāo)記TdR后即可成功參與DNA合成代謝過程。通過測定細(xì)胞的放射性強(qiáng)度，來檢測細(xì)胞的增殖情況。

???ATP含量測定

死細(xì)胞或即將死亡的細(xì)胞幾乎不含ATP，ATP與活細(xì)胞數(shù)目具有良好的線性關(guān)系。當(dāng)細(xì)胞死亡時(shí)，ATP會迅速水解，借助ATP依賴的熒光素酶（Luciferase）催化的螢火蟲熒光素（Luciferin）發(fā)光反應(yīng)測量其發(fā)光值，發(fā)光值與ATP量成正比。此方法適合高通量篩選檢測。

???熒光探針法

目前主要分為兩種：CFDA-SE和Calcein AM。

Part.1 CFSE（羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯）

是一種可穿透細(xì)胞膜的熒光染料。能夠被動擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，其本身不具備熒光，直至被細(xì)胞內(nèi)非特異性酯酶水解以產(chǎn)生熒光，它既可用于細(xì)胞示蹤，也可用于細(xì)胞增殖檢測。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行分裂增殖時(shí)，具有熒光的胞質(zhì)蛋白被平均分配到第二代細(xì)胞中，這樣與第一代細(xì)胞相比，其熒光強(qiáng)度便會減弱至一半；以此類推，分裂得到的第三代細(xì)胞的熒光強(qiáng)度便會比第二代細(xì)胞再次減弱。在488nm的激發(fā)光下，采用流式細(xì)胞儀檢測分析，通常用FITC通道檢測。

Part.2 Calcein AM（鈣黃綠素乙酰氧基甲酯）

增強(qiáng)的疏水性使其能夠輕松穿過細(xì)胞膜，穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成 Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。Calcein ?AM的細(xì)胞毒性很低。Calcein的激發(fā)和發(fā)射波長分別為490 nm和515 nm。因此，Calcein AM是目前最理想的活細(xì)胞熒光探針之一。Calcein-AM常常與死細(xì)胞熒光探針PI（Propidium iodide）聯(lián)合使用，檢測細(xì)胞毒性和凋亡。

???發(fā)光活細(xì)胞

CellTiter-Glo（CTG）是基于ATP檢測的快速細(xì)胞活力檢測法(原理如下圖)，是公認(rèn)的高靈敏度發(fā)光檢測法，是細(xì)胞活力檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，在國內(nèi)外被廣泛應(yīng)用。一步法，均質(zhì)檢測，操作時(shí)間只需要10min。

???其他相關(guān)增殖指標(biāo)檢測

可通過免疫組化的方法檢測增殖細(xì)胞特異性表達(dá)的某些特定蛋白，如增殖細(xì)胞核抗原PCNA，細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67和微小染色體維持蛋白MCM等。Ki-67是檢測比較多的增殖指標(biāo)，既可以免疫組化檢測也可以流式檢測，流式檢測的時(shí)候需要破核。

以上就是檢測細(xì)胞增殖的方法分類，大家要根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)方案和需求選擇合適的實(shí)驗(yàn)方案。

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