三陰性乳腺癌（TNBC）是一種異質(zhì)性的疾病，也是目前乳腺癌治療中最棘手的一種，死亡率最高、且最容易復發(fā)。臨床上，由于缺乏分子靶點，TNBC的治療受到限制，與其他類型的乳腺癌患者相比，患者的預后和總生存期較差。因此，臨床上迫切需要開發(fā)靶向?TNBC?療法。外泌體由多種細胞類型釋放，存在于生物體液中，并已被確定為腫瘤進展的重要介質(zhì)。且已發(fā)現(xiàn)?TNBC?衍生的外泌體在癌癥進展中起關鍵作用。因此，分析外泌體的蛋白質(zhì)特征是?TNBC?治療中一種很有前景的策略。

文章標題：Proteomic Landscape of Exosomes Reveals the Functional Contributions of CD151 in Triple-Negative Breast Cancer.（IF =7.381）

發(fā)表時間：2021.07

背景

三陰性乳腺癌（TNBC）是乳腺癌的一種侵襲性亞型。由于分子治療靶點有限，TNBC?患者的總生存期較差。外泌體被認為是癌癥進展的關鍵介質(zhì)，但TNB?衍生的外泌體的分子成分和功能仍然未知。建立更全面的TNBC患者外泌體蛋白質(zhì)組學圖譜，探索DEPs在外泌體中的功能，對臨床醫(yī)生和研究人員具有重要價值。

文章重點

使用定量蛋白質(zhì)組學比較了來自TNBC患者和健康供體的血清外泌體的完整蛋白質(zhì)表達特征，發(fā)現(xiàn)CD151在TNBC衍生的外泌體中高度富集。CD151通過外泌體調(diào)節(jié)核糖體和補體蛋白的分泌，CD151缺失的外泌體顯著降低了TNBC細胞的遷移和侵襲。TNBC衍生的外泌體蛋白分析是擴展對TNBC理解的有用工具，外泌體CD151可能是TNBC的潛在治療靶點。

研究思路

研究內(nèi)容

01血清外泌體的鑒定和表征

通過超速離心從血清樣品中分離外泌體。使用透射電子顯微鏡?(TEM)、免疫印跡和?NTA?來表征血清外泌體，確定分離的外泌體的相對純度和形態(tài)。TEM分析表明，分離出的納米囊泡具有典型的杯狀結(jié)構(gòu)，直徑在30~150 nm范圍內(nèi)。WB分析顯示，在樣品中檢測到了外泌體蛋白標志物TSG101、HSP70、Alix和CD63，而鈣網(wǎng)蛋白是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)駐留蛋白，僅在MDA-MB-231全細胞裂解物中檢測到。NTA?顯示，經(jīng)過2000?倍稀釋后，粒子的濃度約為5.7×107?，模式尺寸約為111.8 nm，與外泌體的大小一致。結(jié)果表明外泌體通過各種測定得到了很好的表征并且高度純化。

02TNBC?患者和健康供體的外泌體的蛋白質(zhì)組分析

作者采用?TMT?定量蛋白質(zhì)組學技術分析來自?TNBC?患者和健康供體的外泌體樣本（10名TNBC?患者和17名健康受試者）,在TNBC?衍生的外泌體中鑒定出共?1050種蛋白質(zhì)。使用組t檢驗并分別識別了96個DEP?與TNBC衍生的外泌體蛋白相關變化（FC > 1.5；FDR < 0.01）。層次聚類的進一步分析表明，單個樣本被分為兩個聚類。在批次?A?中觀察到輕微的批次效應，但生物學參數(shù)（患者組和健康組）緊密地聚集在一起，表明數(shù)據(jù)適合于提取有意義的生物信息。同時，這些結(jié)果還表明，各組內(nèi)蛋白質(zhì)的表達水平存在差異，表明個體之間存在差異。

為了探索已識別的?DEP?的功能，對?DEP?進行通路富集分析。發(fā)現(xiàn)TNBC?衍生的外泌體可能通過傳遞細胞信息在整合素調(diào)節(jié)的腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。受試者的外泌體中下調(diào)?DEP?在與補體和凝血級聯(lián)相關的蛋白質(zhì)中顯著富集。也參與到補體的初始觸發(fā)、血液凝固、蛋白水解的負調(diào)節(jié)、細胞殺傷和內(nèi)吞作用之中。為了在上述富集途徑中找到樞紐蛋白，作者將與這些途徑相關的蛋白質(zhì)輸入到STRING數(shù)據(jù)庫中以構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡，并在cytoHubba中執(zhí)行最大團中心性算法，以及具有前五個最大團中心性的蛋白質(zhì)值被過濾為中心蛋白。在補體和凝血級聯(lián)通路中排名靠前的蛋白質(zhì)包括C8、VTN、C5?和C9。在整合素細胞表面相互作用和黏著斑信號通路中，ITGB1?是該算法排名第一的蛋白質(zhì)。此外，在?ITGA6-ITGB1-CD151?復合物中，外泌體整合素（ITGA6?和?ITGB1）已被證明可促進肺轉(zhuǎn)移，因此中樞蛋白?CD151?可能通過調(diào)節(jié)整合素分泌在?TNBC?中發(fā)揮重要作用。

為了驗證?MS?結(jié)果，選擇補體和凝血級聯(lián)通路中的中樞蛋白C5、整合素細胞表面相互作用通路中的ITGB1和ITGA6-ITGB1-CD151?復合物中的CD151?進行驗證。來自另外12名TNBC?患者和12?名健康供體的血清樣本通過WB進行了獨立評估。與健康供體樣品相比，TNBC血清樣品中CD151和ITGB1的相對表達水平升高，而C5水平降低，與蛋白質(zhì)組學結(jié)果一致。

03CD151?在TNBC患者來源和MDA-MB-231細胞來源的外泌體中顯著富集

CD151在癌癥中的作用已有越來越多的證據(jù)，由于從未報道過CD151在TNBC?外泌體中的作用，被作者選中進行進一步研究。作者驗證了來自?TNBC?血清樣本、乳腺癌細胞裂解物和來自乳腺癌細胞的外泌體中CD151的表達。結(jié)果表面與正常志愿者來源的外泌體相比，CD151?在TNBC來源的外泌體中顯著表達。表明外泌體CD151可用作區(qū)分?TNBC?患者與健康受試者的生物標志物。此外，作者在一組五個乳腺癌細胞系中測試了CD151表達水平。CD151在TNBC細胞系MDA-MB-231中上調(diào)明顯。同時在源自這些乳腺癌細胞系的外泌體中評估了CD151水平，發(fā)現(xiàn)CD151在TNBC細胞系MDA-MB-231分泌的外泌體中顯著富集。

04CD151?通過外泌體調(diào)節(jié)多種蛋白質(zhì)的分泌

為了測試CD151的功能，作者在MDA-MB-231細胞中使用?CRISPR-Cas9技術敲除CD151。對CD151KO (231-CD151KO)?和對照細胞?(231-Control)?進行WB檢測。CD151蛋白表達在231-CD151KO中完全消除，說明CD151被成功敲除，并且在外泌體中觀察到相同的結(jié)果（231-CD151KO-Exo與231-Control-Exo）。接下來進行外泌體和細胞蛋白的穩(wěn)定同位素?6-plex TMT?標記。通過定量蛋白質(zhì)組學對?2032?種外泌體蛋白和?6849?種細胞蛋白進行了定量。對于細胞蛋白質(zhì)組和細胞衍生的外泌體蛋白質(zhì)組，我們通過?Pearson?相關性獲得了?0.999和0.998?的平均相關性。發(fā)現(xiàn)?231-CD151KO-Exo?和231-Control-Exo?中的外泌體蛋白譜存在顯著差異，但231-CD151KO?和?231-Control?細胞中的這些蛋白略有不同。表明?CD151?可能通過外泌體調(diào)節(jié)許多蛋白質(zhì)的分泌，而不是控制它們在細胞中的表達。

05CD151?通過外泌體促進核糖體蛋白分泌并抑制補體蛋白分泌

在量化的外泌體蛋白中，759?種蛋白表現(xiàn)出高（>1.5）的?KO/WT?比率，表明CD151抑制了這些外泌體蛋白的分泌。相比之下，481?種蛋白質(zhì)的?KO/WT?比率較低（<0.667），表明CD151增強了這些外泌體蛋白的分泌。然而，在量化的細胞內(nèi)蛋白（6849）中，僅鑒定出?64?個DEP。表明?CD151通過外泌體調(diào)節(jié)大量蛋白質(zhì)的分泌，而不是調(diào)節(jié)它們的表達。KEGG對?exo-DEP?的分析表明，DEP?參與了補體和凝血級聯(lián)反應、冠狀病毒、細胞外基質(zhì)-受體相互作用、核糖體和內(nèi)吞作用。231-CD151KO-Exo?中高表達的蛋白質(zhì)在補體和凝血級聯(lián)、氨基酸生物合成、內(nèi)吞作用、粘著斑和血小板活化中富集。這些結(jié)果表明，CD151可能通過TNBC?患者的外泌體抑制補體相關蛋白的分泌。在下調(diào)的Exo-DEP?中，46?個是核糖體蛋白。為了研究這些蛋白質(zhì)的分泌是否受CD151?的調(diào)節(jié)，挑選了六種核糖體蛋白（RPL6、RPL13、RPL24、RPS3A、RPS8和RPS10）和三種補體蛋白（C3、C5?和C7）。與231-Control-Exo?相比，六種選定的核糖體蛋白在?231-CD151KO-Exo?中的表達水平較低，但三種補體蛋白在?231-CD151KO-Exo?中的表達水平高于?231-Control-Exo，與蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)一致。這些發(fā)現(xiàn)表明外泌體?CD151?促進核糖體蛋白分泌并通過外泌體抑制補體蛋白分泌。

06CD151?外泌體?CD151?在體外促進?TNBC?細胞遷移和侵襲

為了驗證外泌體?CD151?是否在體外促進?TNBC?細胞移動性和侵襲性，將?TNBC?細胞系（MDA-MB-468和MDA-MB-231）、對照外泌體和?CD151KO?外泌體共培養(yǎng)?24?小時。Transwell?實驗表明，與PBS?對照組相比，231-Control-Exo培養(yǎng)的MDA-MB-468和MDA-MB-231細胞表現(xiàn)出增強的細胞遷移和侵襲能力。外泌體中CD151的消耗降低了?MDA-MB-468?和MDA-MB-231?細胞的遷移率。與231-Control-Exo?組相比，其消耗也下調(diào)了MDA-MB-468和MDA-MB-231細胞的侵襲潛力。證明了外泌體CD151?在調(diào)促進TNBC細胞遷移和侵襲方面的功能。

總結(jié)：

作者從?TNBC?患者中鑒定出1050?種外泌體蛋白，分析了總共?96?個DEP?。發(fā)現(xiàn)已鑒定的DEP?參與整合素細胞表面相互作用、調(diào)節(jié)胞吐作用、ITGA6-ITGB1-CD151?復合物以及補體和凝血級聯(lián)反應。而后將?CD151?鑒定為一種在來自?TNBC?患者血清和?TNBC?細胞培養(yǎng)上清液的外泌體中高度表達的蛋白質(zhì)，表明?CD151?在血清外泌體中的表達增加可能是?TNBC?的診斷生物標志物。證明了CD151?在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分泌和促進?TNBC?細胞遷移和侵襲方面的功能。