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2022年08月02日，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部孫林峰教授團(tuán)隊(duì)在Nature雜志上發(fā)表了題為“Structural insights into auxin recognition and efflux byArabidopsisPIN1”的研究論文，報(bào)道了植物中生長素極性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PIN1單獨(dú)的（apoform），與底物生長素結(jié)合的（IAA-bound），以及與抑制劑NPA（N-1-naphthylphthalamic acid，又名抑草生）結(jié)合的（NPA-bound）三個(gè)高分辨率結(jié)構(gòu)，并結(jié)合功能實(shí)驗(yàn)闡釋了PIN1蛋白的工作機(jī)制，為理解植物生長素運(yùn)輸調(diào)控、以及針對PIN蛋白的農(nóng)業(yè)用除草劑和植物生長調(diào)節(jié)劑的設(shè)計(jì)開發(fā)提供了重要基礎(chǔ)。

早在1880年，達(dá)爾文父子在《植物的運(yùn)動力》（“ThePower of Movements in Plants”）一書中，就提出了植物莖頂端會產(chǎn)生某種物質(zhì)，導(dǎo)致“向光性”生長的猜想。1928年荷蘭科學(xué)家F.Went通過著名的“溫特實(shí)驗(yàn)”（燕麥胚芽鞘彎曲實(shí)驗(yàn)）證實(shí)了這種物質(zhì)的存在并首次提出了“生長素”的概念?？茖W(xué)家進(jìn)一步的研究確定植物中主要的生長素為吲哚-3-乙酸（IAA, Indole-3-acetic acid）。作為第一種被發(fā)現(xiàn)的植物激素，生長素幾乎參與了植物生長發(fā)育調(diào)控的每一個(gè)過程，比如胚胎發(fā)育、根發(fā)育、葉發(fā)育、花發(fā)育、向光性和向重力性等。區(qū)別于其它植物激素，生長素的一個(gè)非常顯著的特點(diǎn)是其細(xì)胞與細(xì)胞間的運(yùn)輸過程具有方向性，這一過程也被稱為生長素極性運(yùn)輸（Polar Auxin Transport, PAT）。生長素極性運(yùn)輸通過與其合成和代謝途徑共同配合，產(chǎn)生濃度梯度和局部濃度差異，建立調(diào)控植物生長發(fā)育、“向性生長”的基礎(chǔ)，響應(yīng)內(nèi)外界信號刺激。在生長素極性運(yùn)輸過程中，位于膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其中生長素外排蛋白家族PIN（PIN-FORMEDauxin exporter）尤為重要。研究表明，PIN蛋白成員在細(xì)胞質(zhì)膜上具有不對稱分布的特點(diǎn)，其極性定位與生長素運(yùn)輸方向高度關(guān)聯(lián)，是生長素在植物體內(nèi)不對稱分布的重要原因。由于缺乏精細(xì)的三維結(jié)構(gòu)，PIN家族蛋白特異性識別、轉(zhuǎn)運(yùn)生長素的機(jī)制一直未知，也是生長素研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問題。NPA是之前在實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用的一種生長素極性運(yùn)輸抑制劑，也是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最早作為除草劑應(yīng)用的化學(xué)小分子。生化證據(jù)表明，NPA可以直接靶向PIN蛋白，但是究竟是如何發(fā)揮作用的一直不清楚。

在模式植物擬南芥中，PIN家族包括8個(gè)蛋白成員，包括經(jīng)典的、主要分布于細(xì)胞膜上的、具有較長胞質(zhì)loop環(huán)的PIN成員（PIN1~PIN4和PIN7），非經(jīng)典的、分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的、具有較短胞質(zhì)loop環(huán)的PIN成員（PIN5和PIN8），以及胞質(zhì)loop環(huán)長度介于二者之間的PIN6蛋白。PIN1是最早鑒定的PIN家族成員之一，其基因突變導(dǎo)致植物產(chǎn)生裸露的針狀（pin-formed）花序，該家族由此得名。在本研究中，孫林峰團(tuán)隊(duì)針對PIN1這一經(jīng)典的PIN家族成員展開研究，首先搭建了一套全新的、基于放射性同位素和哺乳動物HEK293T細(xì)胞的、檢測PIN1蛋白生長素外排功能的生化體系，不僅驗(yàn)證了其轉(zhuǎn)運(yùn)活性，證實(shí)了PIN1受蛋白激酶激活調(diào)控、被NPA抑制的過程，也為PIN介導(dǎo)的生長素運(yùn)輸機(jī)制研究提供了一種可靠的便捷手段。此外，團(tuán)隊(duì)還利用質(zhì)譜分析技術(shù)，鑒定了多個(gè)位于胞質(zhì)loop環(huán)的磷酸化位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究PIN受磷酸化調(diào)控的機(jī)制提供了線索。

在功能分析的同時(shí)，團(tuán)隊(duì)利用HEK293F細(xì)胞瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)、純化得到了擬南芥PIN1蛋白。為了解決蛋白構(gòu)象不穩(wěn)定及分子量較小的問題，孫林峰團(tuán)隊(duì)與中國科學(xué)院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心李典范團(tuán)隊(duì)合作，利用體外納米抗體合成技術(shù)，得到了大量靶向PIN1蛋白的納米抗體，進(jìn)一步通過親和力、熱穩(wěn)定性分析縮小了抗體篩查范圍。最終，團(tuán)隊(duì)利用冷凍電鏡單顆粒重構(gòu)技術(shù)，成功解析了PIN1與一種納米抗體結(jié)合的、分辨率為3.0埃的結(jié)構(gòu)，首次揭示了經(jīng)典PIN家族蛋白成員的樣貌。PIN1以對稱性的同源二聚體方式組裝。每個(gè)PIN1單體具有10次跨膜螺旋，呈現(xiàn)出典型的NhaA蛋白折疊方式，劃分為Scaffold結(jié)構(gòu)域和Transporter結(jié)構(gòu)域。PIN1呈現(xiàn)向細(xì)胞質(zhì)側(cè)開放的構(gòu)象，同時(shí)在胞質(zhì)側(cè)，還具有一個(gè)由b折疊片組成的結(jié)構(gòu)域，區(qū)別于近期報(bào)道的同家族成員PIN8蛋白的結(jié)構(gòu)。通過在蛋白中添加底物IAA和抑制劑NPA，團(tuán)隊(duì)又分別得到了PIN1蛋白分別與兩種小分子結(jié)合的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。在這些結(jié)構(gòu)中，清楚地看到了IAA和NPA結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)以及相互作用氨基酸殘基，并通過突變、ITC結(jié)合常數(shù)測定和轉(zhuǎn)運(yùn)分析驗(yàn)證了這些殘基的重要性。雖然IAA和NPA在結(jié)合方式上具有一定相似性，但是由于NPA分子更大，通過與PIN1產(chǎn)生更多的氫鍵和疏水性相互作用，以一種親和力更高的方式結(jié)合，并使蛋白處于朝內(nèi)側(cè)開放的構(gòu)象，從實(shí)驗(yàn)上驗(yàn)證了NPA的高效抑制作用。除此之外，團(tuán)隊(duì)還討論了PIN家族蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)IAA的驅(qū)動力和能量來源，通過轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)跨膜質(zhì)子梯度對于IAA運(yùn)輸影響較小，暗示PIN不依賴于質(zhì)子梯度提供能量。

圖1. 擬南芥PIN1蛋白三種狀態(tài)下的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制示意圖。

綜上，該研究揭開了植物經(jīng)典PIN家族蛋白的結(jié)構(gòu)面紗，系統(tǒng)闡釋了PIN1識別底物生長素IAA以及被NPA抑制的分子機(jī)制，為我們深入理解植物生長素極性運(yùn)輸過程提供了重要幫助，也為基于靶向該家族蛋白的小分子抑制劑設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)，對于指導(dǎo)農(nóng)業(yè)應(yīng)用具有重要意義。

中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部楊智森、夏婧，以及中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心洪晶晶為該論文共同第一作者，中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部劉欣副研究員、孫林峰教授為共同通訊作者，中科院分子細(xì)胞科學(xué)卓越創(chuàng)新中心李典范研究員、奧地利科學(xué)技術(shù)研究院Ji?íFriml教授、中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部譚樹堂教授及中科大冷凍電鏡中心高永翔博士均參與了該項(xiàng)研究工作。該工作得到了中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)基金（B類）、國家自然科學(xué)基金、安徽省自然科學(xué)基金、中央高?；A(chǔ)科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金及中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)統(tǒng)籌推進(jìn)世界一流大學(xué)和一流學(xué)科建設(shè)專項(xiàng)資金等項(xiàng)目的資助，以及教育部無膜細(xì)胞器與細(xì)胞動力學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國家研究中心、生物醫(yī)學(xué)與健康安徽省實(shí)驗(yàn)室的大力支持。冷凍電鏡數(shù)據(jù)收集工作在中科大冷凍電鏡中心和生物物理所生物成像中心完成。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41586-022-05143-9

（生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部、科研部）