●?前言

2021年12月美國賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院費城兒童醫(yī)院兒科腫瘤科David T. Teachey教授課題組在Nature?communication發(fā)表了題為“Proteomic profiling of MIS-C patients indicates?heterogeneity relating to interferon gamma?dysregulation and vascular endothelial dysfunction”的研究成果，通過基于Olink平臺的蛋白質(zhì)組學(xué)、流式細胞分選等研究方法，從MIS-C疾病的兩個重要方面著手，探究了細胞因子產(chǎn)生過多和血管內(nèi)皮功能障礙機理，為該疾病診治的科學(xué)性提供了理論依據(jù)。

中文標(biāo)題：MIS-C患者的蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示干擾素γ失調(diào)和血管內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的異質(zhì)性

研究對象：多系統(tǒng)炎癥患兒（MIS-C）

發(fā)表期刊：Nat?communication

影響因子：14.919

發(fā)表時間：2021年12月

合作單位：美國賓夕法尼亞大學(xué)佩雷爾曼醫(yī)學(xué)院費城兒童醫(yī)院

運用生物技術(shù)：基于Olink蛋白質(zhì)組學(xué)、流式細胞術(shù)

●?研究背景

2020年，兒童全身炎癥綜合征(MIS-C)成為感染SARS-CoV-2后的主要兒科并發(fā)癥，常表現(xiàn)為發(fā)熱以及炎癥，僅進行靜脈注射免疫球蛋白治療時往往效果欠佳，具體的致病機理也待考究。

休克是MIS-C患兒的顯著特征，同時嚴重MIS-C和SARS-CoV-2的感染均能成為細胞因子風(fēng)暴的潛在驅(qū)動因素。使用托珠單抗或阿那白滯素等藥物能在一定程度上阻斷細胞因子失調(diào)，但是，最佳靶向藥物尚未確定。深入了解這些患者的細胞因子如何失調(diào)對于確定合理的靶向治療至關(guān)重要。

除休克和炎癥以外，血栓性微血管?。═MA）的風(fēng)險也會在MIS-C和感染SARS-CoV-2患兒中升高。但MIS-C中TMA的致病機制與細胞因子失調(diào)的關(guān)聯(lián)仍不清楚。

●?研究思路

●?研究結(jié)果

1.?感染SARS-CoV-2和MIS-C患兒血漿蛋白質(zhì)組的整體情況說明

利用88名患者血漿，采用Olink Explore 1536/384 panel平臺進蛋白質(zhì)組學(xué)研究，20名患者（MIS-C，N=8，重癥COVID19，N = 6，輕癥SARS-CoV-2感染，N = 6）（樣本策略）的流式數(shù)據(jù)于Vella等人已報道的文獻中摘出。通過對數(shù)據(jù)進行無偏倚的t分布隨機鄰域嵌入（tSNE）可視化分析（圖1），MIS-C 患者與急性 SARS-CoV-2患者或健康患者的聚類不同。原有文獻證明MIS-C與CD8+ T細胞和Tbet+漿母細胞活化有關(guān)。但將該數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)疊加后發(fā)現(xiàn)MIS-C 簇內(nèi)活化的CD8+ T細胞百分比和Tbet+漿母細胞百分比卻存在異質(zhì)性。

圖1 | Olink血漿蛋白組研究

與健康對照組 (N = 25) 相比，MIS-C (N = 22)、輕癥 (N = 26)和重癥(N = 15)血漿蛋白質(zhì)組的總體情況說明

2.描繪MIS-C和SARS-CoV-2感染患者的激活途徑

使用差異表達蛋白質(zhì)（DEP）來描述MIS-C、輕癥和重癥與健康患者之間的差異。值得注意的是，與健康患者相比，PLA2G2A在所有三組之間均展示很大差異，其中最顯著的差異發(fā)生在 MIS-C 患者與健康對照間。為了確定與 MIS-C 和COVID-19患兒的致病機理相關(guān)通路，使用 pathfindR對蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用進行了分析（圖2a-c）。在感染SARSCoV-2 的所有分類中，細胞因子-細胞因子和趨化因子-細胞因子受體通路均失調(diào)。值得注意的是，與健康對照相比，MIS-C、輕癥和重癥患者的類似途徑受到干擾。重癥中的大多數(shù) DEP 在 MIS-C 中也有差異表達，直接評估了這些組之間的 DEP，差異非常小。

圖2 |與健康對照相比，每種疾病狀態(tài)的差異表達蛋白質(zhì)和通路分析

a)?MIS-C (N = 22) 和健康對照 (N = 25) 患者之間的差異表達蛋白 (DEP，同時滿足篩選條件log2>2，F(xiàn)DR<0.01)，以及通路分析排序（點的大小代表富集基因的數(shù)量，顏色的強度代表與富集分析相關(guān)的 p值）

b)?與健康對照組 (N = 25) 相比，輕癥（N = 26) 的患者的 DEP 和通路分析排序

c)?與健康對照組 (N = 25) 相比，重癥（ N = 15) 患者的 DEP 和通路分析排序

d) MIS-C（N = 22）患者和健康對照之間所涉及通路的網(wǎng)絡(luò)分析，其中上調(diào)的蛋白質(zhì)顯示為紅色，下調(diào)的蛋白質(zhì)顯示為橙色。通路項的節(jié)點大小代表通路中涉及的輸入蛋白的數(shù)量。

3.?MIS-C 的特點是對干擾素 γ 的反應(yīng)不成比例

重癥和MIS-C患兒的 IFNγ 水平都很高，無法根據(jù)IFNγ 水平將兩組區(qū)分開，但是IL-10 可以。為了更好地理解這兩種細胞因子，作者研究了 IFNγ 和 IL-10 之間的相關(guān)性及其模式反應(yīng)蛋白和負責(zé)其產(chǎn)生的細胞群的相關(guān)蛋白。

作者檢測了CXCL9作為與IFNγ 反應(yīng)相關(guān)的關(guān)鍵蛋白，發(fā)現(xiàn)所有感染 SARS-CoV-2 的患者都顯示 CXCL9 和 IFNγ 呈正相關(guān)。引人注目的是，與其他組相比，MIS-C 患者對 IFNγ 的 CXCL9 反應(yīng)異常高。為了探究 IFNγ 產(chǎn)生的來源，將 IFNγ 水平與活化 T 細胞 (IL2RA)、NK 細胞 (NCR1) 和巨噬細胞 (CD163) 的可溶性標(biāo)志物相關(guān)聯(lián)。MIS-C 患者的 IFNγ 水平與 IL2RA 和 NCR1 顯著相關(guān)，但與 CD163 無關(guān)，表明 IFNγ 水平與 T 細胞和 NK 細胞相關(guān)，但與巨噬細胞無關(guān)（圖3a）。

MIS-C 患者的 IL-10 水平顯著高于重癥患者，其模式受體IL12B應(yīng)該被 IL10所抑制。在 MIS-C 患者中，IL12B 與 IL-10 呈負相關(guān)，但在輕度、重度或健康患者中不相關(guān)。由此可證明，IL-10 的產(chǎn)生與活化的 T 細胞和巨噬細胞的標(biāo)志物顯著相關(guān)，但與 NK 細胞無關(guān)（圖3b）。

作者隨后從流式數(shù)據(jù)中檢查了 IFNγ、CXCL9 和 IL-10 與活化的 CD8+ 和 CD4+ T 細胞之間的關(guān)系，以進一步探討這些相關(guān)性（圖3c、d）。作者發(fā)現(xiàn) CXCL9 與這兩種細胞類型顯著且強烈相關(guān)，但 IFNγ 則不然。IL-10 與活化的CD4+細胞顯著相關(guān)。

圖3 |?IFNγ 和 IL-10 反應(yīng)和相關(guān)的細胞類型

a)?MIS-C（N = 22)，與健康對照（N = 25），輕癥感染（N = 26），COVID-19（N = 15）相比，IFNγ 信號傳導(dǎo)與其模式反應(yīng)蛋白 (CXCL9) 以及與活化 T 細胞 (IL2RA)、NK 細胞 (NCR1) 和巨噬細胞 (CD163) 相關(guān)的蛋白質(zhì)之間的 Spearman 相關(guān)性

b)?IL-10 與其經(jīng)典受體 IL12B 以及每種疾病類別的 IL2RA、NCR1 和 CD163 之間的相關(guān)性

c)?HLADR+CD38+ CD8+ T 細胞 (N = 19) 與 IFNγ、CXCL9 和 IL-10 之間的相關(guān)性

d)?HLADR+CD38+ CD4+ T 細胞 (N = 19) 與 IFNγ、CXCL9 和 IL-10 之間的相關(guān)性

4.?MIS-C 患者具有以 IFNγ 和 CXCL9 信號傳導(dǎo)為特征的 MAS 樣表型

MIS-C 患者對 IFNγ 的過度反應(yīng)和過度表達的 CXCL9 可誘發(fā)巨噬細胞活化綜合征 (MAS)。MAS 是一種高炎癥狀態(tài)，發(fā)生在風(fēng)濕病、感染或作為原發(fā)性疾病的情況下，其特征是淋巴細胞和巨噬細胞在IFNγ 產(chǎn)生的情況下過度活化。作者研究了 IFNγ、CXCL9 和其他與 MAS 相關(guān)的標(biāo)志物是否可以區(qū)分不同的感染SARS-CoV-2 結(jié)果。無監(jiān)督的層次聚類顯示了兩組不同的 MIS-C 患者，它們的大多數(shù) MAS 標(biāo)志物都有升高。這兩個簇的主要區(qū)別在于它們的 IFNγ 表達，其中 IFNγ 高組與 IFNγ 低組表現(xiàn)明顯（圖 4a）。CD163、CXCL9、IFNγ、IL2RA 和 VSIG4 在符合 MAS 標(biāo)準的患者中顯著升高（圖 4b），并且發(fā)現(xiàn)符合 MAS 標(biāo)準的患者入院期間的最大鐵蛋白顯著高于不符合 MAS 標(biāo)準的患者，但疾病組之間沒有顯著差異（圖 4c，d）。在急性期和恢復(fù)期樣本的 MIS-C 患者中（N = 12），IFNγ、CXCL9 和 IL2RA 均隨時間顯著降低（圖 4e）。

MAS 通常與血細胞減少有關(guān)，包括中性粒細胞減少。相比之下，MIS-C 的特征是顯著的中性粒細胞增多，并且在符合 MAS 標(biāo)準的患者中，絕對中性粒細胞計數(shù) (ANC) 偏高是十分明確的（圖 4f）。MIS-C 患者的 ANC 顯著高于重度或輕度患者（圖 4g）。在 MIS-C 患者中，中性粒細胞增多與 IFNγ 或 CXCL9 無關(guān)，但與 CD163 密切相關(guān)，這意味著這些患者的中性粒細胞增多與巨噬細胞活化有關(guān)（圖 4h），但與 IFNγ或 CXCL9沒有直接關(guān)系。

圖4 | 與 MAS 和 MIS-C 和 SARS-CoV-2 感染患者的關(guān)聯(lián)

a)??MAS 相關(guān)蛋白 IFNγ、CXCL9、CD163、IL2RA、VSIG4 和 HMOX1 熱圖，無監(jiān)督層次聚類(N = 88)

b)?符合 MAS 標(biāo)準的患者 (N = 17) 和不符合 (N = 23) 標(biāo)準的患者的 MAS 相關(guān)蛋白水平箱線圖

c)?符合 MAS 標(biāo)準的患者 (N = 17) 和不符合 (N = 23) 標(biāo)準的患者入院期間的log2 轉(zhuǎn)化后最大鐵蛋白中位數(shù)箱線圖

d)?MIS-C (N = 21)、重癥 (N = 13) 和輕癥 (N = 6) 患者，log2 轉(zhuǎn)化后入院期間最大鐵蛋白中位數(shù)箱線圖

e)?急性和恢復(fù)期樣本的 MIS-C 患者的每種 MAS 相關(guān)蛋白的急性期和恢復(fù)期水平（N = 12）

f)?符合 MAS 標(biāo)準的患者 (N = 17) 和不符合 (N = 23) 標(biāo)準的患者的入院期間最大絕對中性粒細胞計數(shù)

g)?MIS-C (N = 22)、重癥 (N = 15) 和輕癥 (N = 26) 患者入院期間的最大絕對中性粒細胞計數(shù)

h)?入院期間最大絕對中性粒細胞計數(shù)與 IFNγ、CXCL9 和 CD163 相關(guān)

5.?PLA2G2A是與血栓性微血管病表型相關(guān)的MIS-C候選生物標(biāo)志物

已有文獻報道，SARS-CoV-2感染與臨床TMA和TMA生物標(biāo)志物SC5b9升高有關(guān)。由于 SC5b9 不包括在 Olink蛋白質(zhì)組學(xué)分析中，將實驗室測量的 SC5b9 水平（N = 75）與血管或血小板功能障礙相關(guān)的 Olink 蛋白相關(guān)聯(lián)，以識別替代生物標(biāo)志物。分層聚類確定 SC5b9 與 PLA2G2A、 PDGFC、 SELE、 CALCA、NOS3、VWA1和TYMP相關(guān)性最高（圖5a）。作者評估了與 SC5b9 高度相關(guān)的蛋白質(zhì)是否能夠識別疾病類別（圖5b）。MIS-C 患者由于非常高的 PLA2G2A 表達和中度的 CALCA 和 TYMP 表達而聚集。MIS-C 和重癥患者之間的 PLA2G2A 和 CALCA 均顯著升高。SARS-CoV-2 感染患者的 PLA2G2A 顯著高于健康患者，MIS-C 患者差異最顯著（圖5c）。在MIS-C患者中，PLA2G2A、SELE、 CALCA 和 VWA1 在急性期和恢復(fù)期之間都有所改善（圖5d）。值得注意的是，PLA2G2A的水平在恢復(fù)期并沒有完全恢復(fù)到正常水平。

滿足 TMA 標(biāo)準與更高的 PLA2G2A 和 CALCA 顯著相關(guān)（圖5e）。與不符合 TMA 標(biāo)準的患者相比，符合 TMA 標(biāo)準的患者在入院期間更可能需要正性肌力藥（N = 34）。鑒于之前假設(shè) PLA2G2A 是 TMA 和微血管病性溶血性貧血的標(biāo)志物，作者檢查了 PLA2G2A 水平是否與入院期間的最低血小板計數(shù)和最低血紅蛋白相關(guān)。PLA2G2A 水平與血小板和血紅蛋白呈負相關(guān)，并按疾病類別分組（圖5f）。

圖5 |?MIS-C 和 SARS-CoV-2 感染患者血栓性微血管病和血管內(nèi)皮功能障礙的證據(jù)

a)?血管和血小板相關(guān)蛋白與SC5B9的相關(guān)矩陣 (N = 75)

b)?與 SC5B9 相關(guān)的候選替代標(biāo)記的熱圖，包括 PLA2G2A、PDGFC、SELE、CALCA、NOS3、VWA1 和 TYMP（N = 88）

c)?每個 SC5B9 相關(guān)蛋白在疾病狀態(tài)下的箱線圖（MIS-C N = 22，重癥 N = 15，輕癥N = 26，健康 N = 25）

d)?急性和恢復(fù)期樣本的 MIS-C 患者的每種 SC5B9 相關(guān)蛋白的急性期和恢復(fù)期水平（N = 12）

e)?符合（N = 13）且不符合血栓性微血管病標(biāo)準（TMA；N = 21）的患者的 SC5B9 相關(guān)蛋白水平箱線圖

f)?入院期間最低血小板計數(shù)和最低血紅蛋白與PLA2G2A的相關(guān)性（MIS-C N = 22，重癥 N = 15，輕癥N = 26，健康 N = 25）

6.?MIS-C患者的臨床異質(zhì)性

接下來，作者研究了 MAS 和 TMA 表型與 MIS-C 之間的重疊部分。在所有可用數(shù)據(jù)用于分析 MAS 和 TMA 的患者中，觀察與 MIS-C 的交叉部分（N = 21）。在 MIS-C 患者（N = 15）中，TMA 和 MAS 無重疊（圖6a）。為了進一步探索 MIS-C 患者之間的異質(zhì)性，作者比較了來自圖 4a 中確定的 IFNγ-高（N = 7）和 IFNγ-低（N = 13）集群的患者，并觀察了這兩個簇之間的 DEP，進行通路和聚類分析，表明細胞因子信號傳導(dǎo)的差異，包括 IL-17 通路。IL-17 是一種中性粒細胞趨化因子，可能與這些患者的中性粒細胞增多有關(guān)（圖6b-d）。高 IFNγ 的 MIS-C 患者具有顯著更高的鐵蛋白（圖6e）。IFNγ 狀態(tài)與纖維蛋白原、二聚體、血小板、血紅蛋白或 ANC 無關(guān)。

為了了解 IFNγ 與 MIS-C 臨床結(jié)果之間的關(guān)系，作者使用對正性肌力藥的需求量作為嚴重程度的替代指標(biāo)。發(fā)現(xiàn)與低IFNγ集群中的患者相比，高 IFNγ 集群中的患者需要正性肌力藥的可能性更低（圖6f），這意味著更高水平的 IFNγ 與 MIS-C 患者的病情較輕有關(guān)。NTproBNP 是與心臟損傷相關(guān)的標(biāo)志物，顯示出類似的趨勢（圖6g）。作者對所有MIS-C 患者進行了這項分析，發(fā)現(xiàn)需要正性肌力藥的患者 NTproBNP 水平較高（圖 6h）。因此，較高水平的 IFNγ 可能與 MIS-C 患者的病情較輕有關(guān)。

在 MIS-C 患者中，CX3CR1+ CD8+ T 細胞和 IFNγ 的激活呈負相關(guān)（圖6i）。然而，CX3CR1 配體 CX3CL1 的水平與 CX3CR1+ CD8+ T 細胞活化無關(guān)（圖6i）。在作者的無偏網(wǎng)絡(luò)分析（圖6d）中，將 CX3CL1 鑒定為富集蛋白（圖6c），并觀察到升高的 CX3CL1 和高 IFNγ 患者之間的關(guān)聯(lián)，證明一組使用正性肌力藥的患者風(fēng)險較低（圖6j）。數(shù)據(jù)表明血漿中的游離 CX3CL1 水平與 CX3CR1+ CD8+ T 細胞活化的頻率無關(guān)（圖6i），這解釋了它們與正性肌力藥需求的不同關(guān)聯(lián)。因此，作者證明具有高 IFNγ 水平的患者不太可能需要使用正性肌力藥，且較低水平的 CX3CR1+ CD8+ T 細胞活化。

圖6?| MIS-C 患者的臨床異質(zhì)性由其 IFNγ 特征定義

a)?符合巨噬細胞活化綜合征 (MAS)、血栓性微血管病 (TMA) 和 MIS-C 標(biāo)準的患者之間的重疊

b)?IFNγ 低（N = 13）和 IFNγ 高（N = 7）患者之間的差異表達蛋白質(zhì)

c-d) IFNγ 低（N = 12）和 IFNγ 高（N = 7）組患者之間差異表達蛋白的無監(jiān)督通路排序和網(wǎng)絡(luò)分析

a)?IFNγ 低和 IFNγ 高組患者入院期間的最大鐵蛋白水平

b)?需要和不需要正性肌力支持的 IFNγ 低（N = 13）和 IFNγ 高（N = 7）組的患者人數(shù)

c)?在 MIS-C 患者中（N = 7）并且不需要正性肌力藥

d)?在 MIS-C 患者中（N = 15）并且不需要正性肌力藥

e)?MIS-C 患者中 IFNγ 水平與 DR+CD38+ 非初始 CD8+ CX3CR1+ T 細胞百分比之間的相關(guān)性（N = 7）

f)?IFNγ 低（N = 13）和 IFNγ 高（N = 7）患者之間的 CX3CL1 水平

● 研究結(jié)論

通過對MIS-C，輕癥SRAS-CoV-2感染者，重癥COVID19患者以及健康對照之間的蛋白質(zhì)組學(xué)差異蛋白和流式數(shù)據(jù)綜合分析，作者逐步明晰與 MIS-C 相關(guān)的復(fù)雜和異質(zhì)的病理生理學(xué)。并確定TMA的重要生物標(biāo)志物PLA2G2A，同時是MIS-C 的候選生物標(biāo)志物。PLA2G2A在幾乎所有 MIS-C 患者的水平都顯著升高，并可區(qū)分 MIS-C 患者與其他 SARS-CoV-2 感染患者。

同時，作者發(fā)現(xiàn)一部分 MIS-C 患者符合 IFNγ 相關(guān)綜合征 MAS的判定標(biāo)準。但發(fā)現(xiàn) IFNγ 高的患者可能不太需要正性肌力藥，這一結(jié)果與其他與 IFNγ 產(chǎn)生失調(diào)相關(guān)的疾病不一致。MIS-C 患者表現(xiàn)出基于 IFNγ 表達的異質(zhì)性。

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參考文獻

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文末看點｜lumingbio

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