一、實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)介

蛋白質(zhì)的純度鑒定可通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法。利用SDS-PAGE電泳方法或毛細(xì)管電泳法（CE-SDS）提供了最簡(jiǎn)單、成本最低，并且在確定樣品中蛋白質(zhì)組分?jǐn)?shù)目方面靈敏度最高的手段，因此最為常用。?SDS 凝膠電泳以及利用電泳測(cè)定分子質(zhì)量和大小的方法 。這個(gè)方法都可以單獨(dú)測(cè)定樣品的純度，方法的選擇取決于希望檢測(cè)待測(cè)蛋白質(zhì)的何種性質(zhì)。

二、基本原理

聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機(jī)械強(qiáng)度好，有彈性，透明，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，對(duì)pH和溫度變化小，沒(méi)有吸附和電滲作用小的特點(diǎn)，是一種很好的電泳支持介質(zhì)。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1、制膠：根據(jù)蛋白樣品的大小制不同濃度的膠，蛋白分子量小就要制高濃度的膠，分子量大的蛋白就制低濃度的膠，制不同厚度的膠所需的濃縮膠和分離膠體積也不一樣。

2、加樣、電泳：過(guò)稍許時(shí)間等膠凝固后把蛋白marker和所需的鑒定的蛋白和標(biāo)準(zhǔn)品蛋白（如BSA）經(jīng)處理后加到加樣孔中，倒入電泳緩沖液接通電源開(kāi)始跑膠。

3、染色、脫色：等示蹤染料溴酚藍(lán)跑至膠末端，關(guān)閉電源，去除濃縮膠后，將分離膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色40分鐘，然后放入脫色液中脫色1小時(shí)，并換脫色液2-3次。

4、結(jié)果：根據(jù)Marker（或者蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)遷移率制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線）判斷蛋白大小，根據(jù)有無(wú)雜帶判定蛋白的純度。根據(jù)BSA標(biāo)準(zhǔn)品條帶的灰度制作標(biāo)曲，并計(jì)算出目的蛋白的相應(yīng)濃度。

四、樣品要求

濃度大于0.5ug/ul,體積大于50ul, 含鹽量不超過(guò)20mM

五、項(xiàng)目?jī)?nèi)容

序號(hào)項(xiàng)目明細(xì)實(shí)驗(yàn)選擇方法備注

1還原性-SDS-PAGE檢測(cè)——上樣緩沖液含還原劑

2非原性-SDS-PAGE檢測(cè)——上樣緩沖液含不含還原劑

3還原性-CE-SDS檢測(cè)關(guān)注輕重鏈、非糖基化重鏈含量比值上樣緩沖液含還原劑

4非還性-CE-SDS檢測(cè)關(guān)注完整的蛋白純度上樣緩沖液含不含還原劑

六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖

圖 1?SDS-PAGE電泳圖??

圖 2?毛細(xì)管電泳純度