在上一篇中我們介紹了利用10×Genomics空間轉(zhuǎn)錄組平臺(tái)研究植物樣本時(shí)，從樣本包埋到玻片染色的基本實(shí)驗(yàn)流程。本文中，小歐針對(duì)實(shí)驗(yàn)流程中最為關(guān)鍵的步驟——切片和貼片實(shí)驗(yàn)中的一些操作小技巧進(jìn)行了整理，希望能幫助大家更好地開展植物空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的項(xiàng)目研究。

切片注意事項(xiàng)tips

tip1：新鮮植物樣本包埋后，內(nèi)部的結(jié)構(gòu)組織也相對(duì)比較脆弱，已經(jīng)使用過的刀片可能已經(jīng)存在肉眼無法看到的小傷口，會(huì)直接體現(xiàn)在植物組織切片的完整性上。因此，對(duì)于植物樣本，在常規(guī)切片的基礎(chǔ)上，應(yīng)盡量使用新刀片，以減小對(duì)組織切片的機(jī)械損失。

tip2：由于植物組織的脆弱性，切片過厚更易造成對(duì)組織表面的損傷，導(dǎo)致組織切面上產(chǎn)生大小不一的空洞。并且，切片過厚容易使目標(biāo)區(qū)域被錯(cuò)過，造成切片浪費(fèi)或者切片樣本損失過多。因此，在調(diào)整切片角度、尋找最佳目標(biāo)區(qū)域的切片樣本處理過程中，可以將切片厚度調(diào)整得薄一點(diǎn)，比如設(shè)定為10um左右。

tip3：多數(shù)情況下，植物樣本的特化結(jié)構(gòu)遠(yuǎn)比動(dòng)物組織樣本還要復(fù)雜。因此，在正式切片前的切片預(yù)調(diào)整階段，務(wù)必要邊切邊隨時(shí)注意觀察組織結(jié)構(gòu)的變化。必要時(shí)，應(yīng)貼片后在顯微鏡下觀察組織切片的情況，根據(jù)切片的實(shí)時(shí)效果來確定如何調(diào)整切片的角度。

tip4：切片過程中，如果遇到組織切面有大小不一的空洞，可能是組織內(nèi)部本身就具有的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，也可能是由于組織表面質(zhì)地較硬，OCT包埋膠無法滲入組織內(nèi)部，起到支持和保護(hù)作用而造成的，還有可能是切片時(shí)的力度或者切片速度不合適而造成的機(jī)械損傷。遇到這種情況，可以在切面上再稍微包裹一層OCT包埋膠，完全覆蓋住組織表面即可，不用過多，使OCT逐漸滲入到組織內(nèi)部，達(dá)到一定程度上的支撐作用。重新切片時(shí)能夠起到緩沖作用，可以在一定程度上改善組織切片的完整性。

tip5：在即將切到目標(biāo)區(qū)域時(shí)，每次切掉的厚度會(huì)直接影響組織剩余量。此時(shí)，可調(diào)整切片厚度到5-8um左右，盡量減少組織材料的浪費(fèi)，當(dāng)切到目標(biāo)區(qū)域時(shí)再及時(shí)調(diào)整切片厚度恢復(fù)至10um即可。

tip6：由于有些植物樣本外有一層較硬的種皮或者萼片，阻止了OCT包埋膠的滲入，切片時(shí)可能造成組織切片和OCT包埋膠脫節(jié)的現(xiàn)象。遇到這種情況的時(shí)候，如果這些組織不屬于研究對(duì)象，則在樣本前期處理時(shí)，應(yīng)在不傷及組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上小心去除此部分結(jié)構(gòu)；若這些組織也屬于研究對(duì)象，則應(yīng)注意每次切片下刀時(shí)的用力程度，應(yīng)該根據(jù)每個(gè)樣本的不同特點(diǎn)而有所區(qū)別。有些樣本適合一刀到底，快速切片，有的樣本卻需要緩慢控制每次下刀時(shí)的力度，才能減輕對(duì)組織切片的傷害。

tip7：由于植物樣本結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，對(duì)于有些樣本，可能每次切開的層面都不盡相同，如果遇到比較難切的樣本，切面容易破碎，可能會(huì)造成每張切片的破碎層度都不盡相同。遇到這種現(xiàn)象，我們只能盡量對(duì)切面進(jìn)行修補(bǔ)以減輕對(duì)后續(xù)切片的影響。在切片完成后，用OCT包埋膠將剩余組織的切面完全包裹覆蓋，一方面可以減輕樣本切面在冰凍過程中可能產(chǎn)生的二次凍傷，另一方面則可以減少下次切開此樣本時(shí)，由于重新調(diào)整切片角度而造成的樣本浪費(fèi)的問題。

貼片注意事項(xiàng)

切片完成后并不意味著整個(gè)切片過程就結(jié)束了，如何把樣本切片又快又好的貼到玻片上，尤其是正式玻片的特定有效捕獲區(qū)域內(nèi)，也是確保后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的關(guān)鍵問題。

對(duì)于動(dòng)物樣本，雖然有些疏松結(jié)締組織或脂肪組織樣本在切片時(shí)也會(huì)出現(xiàn)易破碎的現(xiàn)象，但對(duì)于大部分比較致密的結(jié)構(gòu)組織樣本，切片和貼片相對(duì)比較容易，對(duì)組織修片（調(diào)整組織大小）也相對(duì)簡(jiǎn)單些。但對(duì)于植物組織樣本而言，則需要關(guān)注到更多操作細(xì)節(jié)。

首先，如何將組織修片到特定的大小范圍內(nèi)就是個(gè)難點(diǎn)。植物樣本結(jié)構(gòu)比較脆弱，在修片過程中非常容易被破壞。因此，為減少修片造成的結(jié)構(gòu)損傷，需注意在前期樣本包埋階段，就應(yīng)盡量把組織大小調(diào)整到合適的范圍內(nèi)（10×Genomics正式玻片上，捕獲區(qū)域?yàn)?.5×6.5mm/樣本），避免樣本過大。如果已經(jīng)出現(xiàn)了樣本過大、貼片時(shí)會(huì)影響到捕獲區(qū)域的貼片效果的情況，則必須進(jìn)行適當(dāng)修片操作。此時(shí)，可盡量用刀片輕輕按壓來減輕對(duì)組織切面帶來的影響，采用邊切邊修的方式，不可一次性修掉太厚組織。

其次，如何將切片展開并完整地貼到玻片上也是需要注意的細(xì)節(jié)。有些樣本在切片展開的過程中容易被拉扯到，造成組織結(jié)構(gòu)破碎、有縫隙或者裂痕、組織邊緣卷邊、組織大范圍卷曲折疊等，甚至有部分組織會(huì)與其他部分脫落，更嚴(yán)重的也可能造成整個(gè)切片因破碎程度較大而無法使用。這種情況就到了考驗(yàn)我們的貼片技術(shù)水平、經(jīng)驗(yàn)以及耐心的時(shí)候，不同的操作人員有不同的經(jīng)驗(yàn)和操作習(xí)慣，也存在著一些個(gè)人小技巧，需要具體情況具體分析，很難梳理成一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)SOP。

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